بروتوكولنا يسمح لإدخال استنساخ الكائنات الحية الدقيقة والعوامل العلاجية في عين الماوس لدراسة التسبب في العدوى داخل العين وفعالية العلاج رواية. يسمح أسلوبنا عدوى داخل العين أن تنشأ في نموذج الماوس ويسهل كمية الكائنات الحية الدقيقة، والاستجابات المضيفة المناعية، العدوى ذات الصلة المضيف والتعبير الجيني الممرض، وفعالية العلاج الرواية. التصور من موقع الحقن، وزاوية إبرة، والتسليم حاسمة لنجاح تنفيذ هذه التقنية والحصاد العين السليم أمر ضروري من أجل كمي من المعلمات العدوى.
في مرفق مستوى السلامة البيولوجية اثنين، إضافة خمسة ملليلتر من مرق BHI إلى أنبوب سقف المفاجئة 10 ملليلتر واستخدام حلقة معقمة لنقل مستعمرة B.cereus واحدة من ثقافة لوحة أوجر إلى خمسة ملليلتر من مرق. بعد دوامة وجيزة، احتضان العينة في حاضنة الدورية 37 درجة مئوية في 200 ثورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة. في نهاية الحضانة ، تمييع الثقافة إلى 200 مستعمرة تشكيل وحدات لكل تركيز microliter في 10 ملليلتر من BHI الطازجة ، وبعد الدوامة ، إضافة ملليلتر واحد من الثقافة المخففة حديثا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر microcentrifuge على الجليد.
للحقن داخل فيريال، بدوره على الحقن المجهري وفتح صمام الغاز على خزان الهواء المضغوط تعلق على الحقن المجهري. اضغط على وضع على الميكروين حتى تظهر الشاشة التوازن. اضغط على "موازنة" ووضع ماوس الكمبيوتر على جدول التشغيل.
قم بتوصيل حامل الماصات الفولاذ المقاوم للصدأ بالأنابيب المرفقة بإخراج التعبئة على المحاقن وبرغي بإحكام موصل حامل الماصات حول إبرة طرف ماصة زجاجية مشطوفة للسماح بإدخال الإبرة الشعرية في الطرف الآخر من حامل الماصات. بدوره على المجهر العيون وتعيين شدة الضوء إلى 50٪ موضع المجهر على موقع الإجراء وضبط المجهر إلى التركيز المطلوب. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس، وضع الماوس تخدير على جانبها الأيسر على underpads الطبية مع الأنف وأشار إلى اليمين.
تحديد موقع العين اليمنى من خلال الهدف المجهر ophthalmic ووضع ملقط من عكس العمل على جانبي العين لفضح موقع الحقن. غادر انقر فوق الماوس متصلا حاقن صغير لملء إبرة شعرية أعدت مع حل البكتيريا المخفف، وتأمين الرأس مع اليد اليسرى، ووضع غيض من الإبرة، مشطوف الجانب، في limbus العين. مع الإبرة في زاوية 45 درجة، ثقب العين، مع الحرص على أن يتم إدخال فقط 0.5 ملليمتر من طرف حاد من الإبرة.
مرة واحدة وقد تم إدراج تلميح إبرة، واستخدام اليد اليسرى إلى الحق انقر على لوحة الماوس لحقن 0.5 ميكرولترات من حل B.cereus. لمنع التسرب، اترك طرف الإبرة داخل عين الماوس لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان قبل إزالتها، ثم حرر ملقط وستعود العين إلى المقبس بنفسها. نقل الماوس إلى قفص الانتعاش على منصة الاحترار مع مراقبة حتى إعادة شغل كامل.
عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، أضف 400 ميكرولترات من PBS مكمّلة بمثبط البروتياز في أنبوب حصاد واحد يحمل التسمية، أنبوب الحصاد الأوتكاسيد لكل عين على الجليد، ووضع ملقط طرف ناعم مفتوح على جانبي العين المصابة. دفع نصائح إلى أسفل نحو الرأس إلى proptose العين. مرة واحدة ملقط وراء الكرة الأرضية العين، والضغط على ملقط معا وسحب ملقط بعيدا عن الرأس لفصل مقلة العين.
ثم ضع مقلة العين على الفور في أنبوب الحصاد المسمى بشكل مناسب. في غضون 60 دقيقة من جمع العينات، ضع أنابيب الحصاد المغلقة في التجانس الأنسجة والتجانس العينات لمدة سنتين، دقيقة واحدة التجانس فترات مع فترة ثانية 30 من الراحة بينهما. بعد التجانس، ووضع العينات على الجليد واستخدام 20 aliquots ميكرولتر من التجانس لتخفيف تسلسلي العينات في 180 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل تخفيف، حتى يتم التوصل إلى عامل واحد من 10 مرات إلى ثمانية السلبية.
بعد ذلك، قم بتسمية كل صف من صف BHI مربع مُدفأ مسبقًا مع تركيز التخفيف المناسب، ومع اللوحة المائلة بزاوية 45 درجة، أضف 10 ميكرولترات من كل تخفيف إلى صفوف فردية في الجزء العلوي من اللوحة. السماح لكل عينة تشغيل حتى تصل تقريبا إلى الجزء السفلي من لوحة قبل وضع لوحة مسطحة. عندما تم امتصاص العينات في أجار، نقل لوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
المستعمرات يجب أن تبدأ في أن تكون مرئية بعد ثماني ساعات من الحضانة. للحصول على تمثيل دقيق للتركيز في العينة، عد الصف الذي يحتوي على ما بين 10 إلى 100 مستعمرات. إن بناء طرف إبرة زجاجية مشطوفة أمر بالغ الأهمية لإيصال البكتيريا إلى منتصف الجسم الزجاجي لعين الماوس.
في هذه الصور، تظهر عصيات cereus تنمو على لوحة أجار الدم وفي أنابيب ثقافة مرق. كما هو موضح في هذا الرسم البياني من التهم البكتيرية بينات من خمس عيون الماوس مختلفة في 10 ساعات بعد العدوى بين واحد من 10 مرات إلى الخامسة و10 مرات إلى مستعمرة السابعة تشكيل وحدات البكتيريا يمكن عادة أن تكون تعافى من العين المصابة واحدة. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو حقن هذا الحجم المناسب من البكتيريا في عين الماوس.
بعد هذا الإجراء، يمكننا دراسة الالتهاب عن طريق الأنسجة، والوسطاء الالتهابيين من قبل ELISA، والتعبير الجيني عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الإنتاجية لتسهيل فهم أفضل للأمراض من هذا المرض.
