Le modèle ex vivo est une méthode utile pour évaluer l’impact de diverses interventions physiologiques et de composés pharmacologiques et de l’absorption musculaire du glucose. Cette technique permet d’évaluer avec précision l’absorption du glucose dans le muscle squelettique isolé de la souris en l’absence de facteurs de confusion pouvant interférer dans un modèle animal intact. Avant de commencer une expérience, allumez le système biographique de bande musculaire intégré et réchauffez les chambres à 30 degrés Celsius.
Ouvrez le logiciel de collecte de données et calibrez les transducteurs forcés pour assurer la comparabilité entre les ensembles de données. Ajoutez quatre millilitres de milieu d’incubation basal préchauffé de 30 degrés Celsius à chaque chambre d’incubation et assurez-vous que le milieu est continuellement oxygéné avec 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone. Placez la souris en position couchée sur un plateau de dissection et confirmez un manque de réponse au réflexe de pédale.
Ensuite, épinglez une seule patte avant avec une aiguille. Utilisez des ciseaux pour retirer la peau de la jambe inférieure jusqu’à ce que le tendon d’Achille et l’articulation du genou soient visibles. Pour la dissection du muscle soléaire, attachez une seule boucle de suture de 0,4 centimètre de diamètre préparée à partir d’un morceau de suture en nylon chirurgical non résorbable de 16 centimètres au tendon d’Achille et fixez la pince peen au tendon d’Achille distalement à la boucle.
Coupez pour libérer les muscles soléaire et gastrocnémien de la patte et faites glisser soigneusement la pince peen sur la souris pour exposer le muscle soléaire. Épinglez les pinces peen et placez une deuxième boucle de suture autour du tendon proximal du muscle soléaire. Coupez le tendon proximal et disséquez le soléaire, y compris les deux boucles de suture attachées, exemptes du muscle gastrocnémien.
Lors de la collecte, utilisez les boucles pour attacher rapidement le muscle soléaire aux crochets respectifs dans l’une des chambres d’incubation. Utilisez une pince pour enlever le fascia recouvrant le muscle antérieur du tibialis. Les tendons distaux des muscles tibialis antérieurs ou EDL doivent être blancs clairs, visibles et séparés les uns des autres.
Coupez le tendon de distillation du muscle antérieur tibialis et disséquez le muscle. Utilisez des pinces pour libérer doucement le muscle EDL des tissus environnants, laissant le muscle intact sans couper les tendons. Placez des boucles de suture individuelles autour des tendons de distillation et de l’EDL proximal.
Lorsque les boucles ont été placées, coupez les tendons pour libérer le muscle EDL avec les boucles de suture attachées et attachez rapidement les boucles aux crochets dans la deuxième chambre d’incubation. Ensuite, ajustez la tension au repos de chaque muscle à environ cinq millinewtons et laissez les muscles s’équilibrer dans le milieu pendant au moins 10 minutes avant de commencer l’expérience. Pour mesurer l’absorption de glucose stimulée par l’insuline, remplacez le milieu d’incubation basal dans les chambres par le milieu d’incubation sans insuline, une concentration d’insuline sous-maximale efficace ou une concentration d’insuline maximalement efficace pour une incubation de 20 minutes.
À la fin de la période de stimulation, remplacer le milieu d’incubation par un milieu d’incubation absorbant le glucose contenant une concentration identique d’insuline pour une incubation de 10 minutes. À la fin de l’incubation de l’absorption du glucose, retirez soigneusement les muscles des chambres d’incubation et lavez les échantillons dans un milieu d’incubation basal glacé. Après le lavage, séchez rapidement les muscles sur du papier filtre et congelez le tissu sans les boucles de suture dans l’azote liquide.
Ensuite, collectez 100 microlitres du milieu d’incubation d’absorption du glucose de chaque chambre pour un stockage de 20 degrés Celsius et une analyse de l’absorption du glucose musculaire. Pour mesurer l’absorption de glucose stimulée par la contraction, placez des électrodes de platine au centre et des deux côtés des muscles dans les chambres d’incubation, et initiez la contraction musculaire immédiatement après avoir remplacé le milieu d’incubation basal par un milieu d’incubation absorbant le glucose. Enregistrez la production forcée de chaque muscle incubé.
Après 10 minutes, recueillir et congeler doucement les muscles comme démontré, en stockant 100 microlitres d’aliquotes du milieu d’incubation de l’absorption du glucose de chaque chambre pour l’analyse de l’absorption du glucose musculaire comme démontré. Pour déterminer la signalisation myocellulaire par analyse western blotting dans le même ensemble d’échantillons musculaires, homogénéiser chaque échantillon musculaire congelé dans 400 microlitres de tampon d’homogénéisation glacé et faire pivoter l’échantillon bout à bout pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, collectez le licate par centrifugeur et mesurez la quantité de protéines d’intérêt dans chaque palette d’échantillons selon les protocoles d’analyse par transfert Western standard.
Pour mesurer l’absorption de glucose dans chaque échantillon, ajouter 150 microlitres de surnageant de chaque échantillon et 25 microlitres de milieu d’incubation d’absorption de glucose des chambres d’incubation correspondantes pour séparer les flacons de comptage de scintillation liquide contenant trois millilitres de liquide de scintillation liquide par flacon. Ensuite, chargez les flacons sur un compteur de scintillation liquide et mesurez la radioactivité de deux désoxyglucoses et mannitol conformément aux directives du fabricant. Dans cette analyse représentative, les taux d’absorption du glucose basal étaient similaires entre les muscles soléaires et EDL isolés chez des souris femelles.
L’absorption de glucose a augmenté dans les muscles soléaires et EDL en réponse à des concentrations d’insuline sous-maximales et maximales efficaces. De plus, les absorptions de glucose sous-maximales et maximales stimulées par l’insuline étaient significativement plus élevées dans le muscle soléaire. En revanche, l’absorption de glucose induite par la contraction était significativement plus élevée dans l’EDL que dans le muscle soléaire.
Ici, la force musculaire maximale produite dans les muscles soléaire et EDL pendant la période de stimulation de 10 minutes peut être observée. Comme prévu, le muscle EDL a généré plus de force pendant la première partie de la période de stimulation, suivie d’un déclin rapide plus tard dans la période de stimulation. Les concentrations sous-maximales et maximales d’insuline ont induit une augmentation de la phosphorylation de la thréonine 308 et de la sérine 588 TBC1D4, tandis que la contraction a induit une augmentation de la phosphorylation de l’AMPK Alpha thréonine 172 et de l’ACC sérine 212.
Ni l’insuline ni la contraction n’ont entraîné de modification de la teneur totale en protéines. Avant d’essayer de mesurer l’absorption du glucose dans les muscles isolés de la souris, il est essentiel de bien pratiquer la dissection des muscles soléaire et EDL. Après l’évaluation de l’absorption du glucose musculaire, le lysat de protéine musculaire restant peut être utilisé pour une analyse biochimique supplémentaire qui peut élucider les changements observés dans les taux d’absorption du glucose.
