Das Ex-vivo-Modell ist eine nützliche Methode zur Bewertung der Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen und pharmakologischer Verbindungen sowie der Aufnahme von Muskelglukose. Diese Technik ermöglicht die genaue Beurteilung der Glukoseaufnahme in isolierten Mausskelettmuskeln in Abwesenheit von Störfaktoren, die in einem intakten Tiermodell stören können. Schalten Sie vor Beginn eines Experiments das integrierte Muskelstreifen-Biographensystem ein und erwärmen Sie die Kammern auf 30 Grad Celsius.
Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware und kalibrieren Sie die erzwungenen Wandler, um die Vergleichbarkeit zwischen den Datensätzen sicherzustellen. Geben Sie vier Milliliter vorerwärmtes 30 Grad Celsius basales Inkubationsmedium in jede Inkubationskammer und stellen Sie sicher, dass das Medium kontinuierlich mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid angereichert ist. Legen Sie die Maus in die Bauchlage auf einem Dissektionsfach und bestätigen Sie eine fehlende Reaktion auf den Pedalreflex.
Stecken Sie dann eine einzelne Vorderpfote mit einer Nadel fest. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut vom Unterschenkel zu entfernen, bis sowohl die Achillessehne als auch das Kniegelenk sichtbar sind. Zur Dissektion des Soleusmuskels befestigen Sie eine einzelne Nahtschelle mit einem Durchmesser von 0,4 Zentimetern, die aus einem 16 Zentimeter großen, nicht resorbierbaren chirurgischen Nylonstück hergestellt wurde, an der Achillessehne und befestigen Sie die Stiftzange an der Achillessehne distal an der Schlaufe.
Schneiden Sie, um die Muskeln Soleus und Gastrocnemius von der Pfote zu lösen, und schieben Sie die Pinzette vorsichtig über die Maus, um den Soleusmuskel freizulegen. Stecken Sie die Pinzette ab und legen Sie eine zweite Nahtschaufe um die proximale Sehne des Musculus soleus. Schneiden Sie die proximale Sehne ab und sezieren Sie den Soleus einschließlich der beiden angebrachten Nahtschlaufen frei vom Musculus gastrocnemius.
Verwenden Sie nach dem Sammeln die Schlaufen, um den Soleusmuskel schnell an den jeweiligen Haken in einer der Inkubationskammern zu befestigen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Faszie zu entfernen, die den vorderen Musculus tibialis bedeckt. Die distalen Sehnen der vorderen oder EDL-Muskeln von Tibialis sollten klar weiß, sichtbar und voneinander getrennt sein.
Schneiden Sie die Destillessehne des vorderen Musculus tibialis ab und sezieren Sie den Muskel aus. Verwenden Sie eine Pinzette, um den EDL-Muskel sanft aus dem umgebenden Gewebe zu befreien und den Muskel intakt zu lassen, ohne die Sehnen zu schneiden. Platzieren Sie einzelne Nahtschlaufen um die Destillations- und proximalen EDL-Sehnen.
Wenn die Schlaufen platziert wurden, schneiden Sie die Sehnen ab, um den EDL-Muskel mit den befestigten Nahtschlaufen zu lösen, und befestigen Sie die Schlaufen schnell an den Haken in der zweiten Inkubationskammer. Passen Sie dann die Ruhespannung jedes Muskels auf etwa fünf Millinewton an und lassen Sie die Muskeln mindestens 10 Minuten lang im Medium ausgleichen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Um die insulinstimulierte Glukoseaufnahme zu messen, ersetzen Sie das basale Inkubationsmedium in den Kammern durch das Inkubationsmedium ohne Insulin, eine submaximal wirksame Insulinkonzentration oder eine maximal wirksame Insulinkonzentration für eine 20-minütige Inkubation.
Ersetzen Sie am Ende der Stimulationsperiode das Inkubationsmedium durch ein Glukoseaufnahmeinkubationsmedium, das eine identische Insulinkonzentration für eine 10-minütige Inkubation enthält. Entfernen Sie am Ende der Glukoseaufnahmeinkubation vorsichtig die Muskeln aus den Inkubationskammern und waschen Sie die Proben in eiskaltem Basalinkubationsmedium. Nach dem Waschen trocknen Sie die Muskeln schnell auf Filterpapier und frieren Sie das Gewebe ohne die Nahtschlaufen in flüssigem Stickstoff ein.
Dann sammeln Sie 100 Mikroliter des Glukoseaufnahme-Inkubationsmediums aus jeder Kammer für die 20-Grad-Celsius-Speicherung und Muskelglukoseaufnahmeanalyse. Um die kontraktionsstimulierte Glukoseaufnahme zu messen, platzieren Sie Platinelektroden zentral und auf beiden Seiten der Muskeln in den Inkubationskammern und leiten Sie die Muskelkontraktion unmittelbar nach dem Ersetzen des basalen Inkubationsmediums durch Glukoseaufnahme-Inkubationsmedium ein. Zeichnen Sie die erzwungene Produktion aus jedem inkubierten Muskel auf.
Sammeln und frieren Sie die Muskeln nach 10 Minuten vorsichtig ein und frieren Sie sie wie gezeigt ein, wobei 100 Mikroliter Aliquots des Glukoseaufnahmemediums aus jeder Kammer für die Muskelglukoseaufnahmeanalyse gespeichert werden, wie gezeigt. Um die myozelluläre Signalgebung durch Western-Blotting-Analyse im selben Satz von Muskelproben zu bestimmen, homogenisieren Sie jede gefrorene Muskelprobe in 400 Mikroliter Eiskalt-Homogenisierungspuffer und drehen Sie die Probe Ende über Ende für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie dann das Likat durch Zentrifugalisierung und messen Sie die Menge an interessantem Protein in jeder Probenpalette gemäß den Standardprotokollen für westliche Blot-Analysen.
Um die Glukoseaufnahme in jeder Probe zu messen, fügen Sie 150 Mikroliter Überstand aus jeder Probe und 25 Mikroliter Glukoseaufnahmeinkubationsmedium aus den entsprechenden Inkubationskammern hinzu, um flüssige Szintillationszählfläschchen mit drei Millilitern flüssiger Szintillationsflüssigkeit pro Durchstechflasche zu trennen. Laden Sie dann die Fläschchen auf einen flüssigen Szintillationszähler und messen Sie die Radioaktivität von zwei Desoxyglucose und Mannit gemäß den Richtlinien des Herstellers. In dieser repräsentativen Analyse waren die basale Glukoseaufnahmeraten zwischen Soleus- und EDL-Muskeln, die von weiblichen Mäusen isoliert wurden, ähnlich.
Die Glukoseaufnahme erhöhte sich in den Soleus- und EDL-Muskeln als Reaktion auf sowohl submaximal- als auch maximal wirksame Insulinkonzentrationen. Darüber hinaus waren sowohl submaximale als auch maximale insulinstimulierte Glukoseaufnahmen im Soleusmuskel signifikant höher. Im Gegensatz dazu war die kontraktionsbedingte Glukoseaufnahme im EDL im Vergleich zum Soleusmuskel signifikant höher.
Hier kann die maximale Muskelkraft beobachtet werden, die in Soleus- und EDL-Muskeln während der 10-minütigen Stimulationsphase erzeugt wird. Wie erwartet, erzeugte der EDL-Muskel im ersten Teil der Stimulationsperiode mehr Kraft, gefolgt von einem schnellen Rückgang später in der Stimulationsperiode. Submaximale und maximale Insulinkonzentrationen induzierten einen Anstieg der Phosphorylierung von Akt Threonin 308 und TBC1D4 Serin 588, während die Kontraktion eine Erhöhung der Phosphorylierung von AMPK Alpha Threonin 172 und ACC Serin 212 induzierte.
Weder Insulin noch Kontraktion führten zu einer Veränderung des Gesamtproteingehalts. Bevor Sie versuchen, die Glukoseaufnahme in isolierten Mausmuskeln zu messen, ist es wichtig, die Dissektion der Soleus- und EDL-Muskeln gründlich zu üben. Nach der Beurteilung der Muskelglukoseaufnahme kann das verbleibende Muskelproteinlysat für zusätzliche biochemische Analysen verwendet werden, die die beobachteten Veränderungen der Glukoseaufnahmeraten aufklären können.
