Bonjour à tous, je m’appelle Dr.Bipasha Bose. Je travaille comme professeur agrégé et responsable du Stem Cells and Regenerative Medicine Center, du Yenepoya Research Center, de l’Université Yenepoya, de Mangalore, en Inde. Maintenant, nous allons démontrer comment détecter pour la présence de ROS qui est, espèces réactives d’oxygène"dans les cultures vivantes à partir des surfaces oculaires de souris qui ont été exposés à diverses doses de rayonnement ultraviolet-C.
L’avantage de cette technique est qu’ici nous pouvons détecter simultanément la présence d’espèces réactives d’oxygène, de cellules vivantes et mortes, sans avoir besoin d’avoir des cellules Vester. Le principe de cette technique réside essentiellement dans la perméabilité des cellules vivantes du colorant DCFDA. DCFDA est un colorant incolore perméant à cellules vivantes, qui pendant le stress oxydatif est agi par les oxydants intracellulaires et se convertit en fluorescing vert DCF.
Ainsi, la florescence verte nous permet de détecter la présence d’espèces réactives d’oxygène dans les cellules vivantes. D’autre part, l’iodure de propidium est un colorant perméant exclusivement à cellules mortes qui fluore le rouge. Il s’agit d’un colorant intercalant à double brin rDNA.
Cependant, le colorant Hoechst est perméant à la fois pour les cellules vivantes et mortes. C’est une tache nucléaire de couleur bleue. Par conséquent, il s’agit d’une méthode très simple dans laquelle nous pouvons détecter la présence d’espèces réactives d’oxygène dans les cultures à long terme d’une manière dépendante du temps avec l’évaluation des cellules mortes.
Plaque point deux millions de cellules par 35 millimètres plats de culture. Les cellules que nous appliquons sont les cellules de la surface oculaire de la souris. Retirez le volume maximal de médias de chacun des plats de culture cellulaire.
Laissez derrière eux environ 500 microlitres de médias de culture cellulaire en contact étroit avec les cellules. Une quantité minimale de médias empêchera le séchage des cellules. Toutefois, le but d’une quantité minimale de médias est de permettre la pénétration maximale de l’exposition aux UVC.
Prenez les cellules sous une source UV, il peut être soit un Crosslinker UV, ou peut être n’importe quelle autre source ultraviolette-C. Exposez les cellules à différentes doses de rayonnement UVC comme une, 10, 100, 1000 et 10 000 joules par mètre carré. Lorsque les cellules se sont exposées au rayonnement ultraviolet-C, les couvercles doivent être en position ouverte.
Cela permettra une pénétration maximale de l’ultraviolet-C dans les cellules et montrera donc la dose-réponse optimale des cellules au rayonnement ultraviolet-C. Apportez les cellules au capot laminaire d’écoulement d’air et réapprovisionnez chacun des plats avec deux millilitres de médias complets. Ce média complet contient 20% de sérum bovin fœtal dans le DMEM, complété par des suppléments tels que 1% minimum d’acides aminés non essentiels, et aussi 1% d’antibiotique qu’est la pénicilline et la streptocotomycine.
Ensuite, après avoir reconstitué avec un volume maximum, c’est-à-dire deux millilitres de supports complets, retourner les plaques à l’incubateur et incuber pendant une période de trois heures afin de voir les premiers effets du rayonnement ultraviolet-C. Préparez les supports de coloration cellulaire en direct dans les 15 dernières minutes de trois heures après l’incubation des cellules UVC. Les supports de coloration sont préparés en 10%FBS contenant DMEM préchauffé à 37 degrés.
Pour faire 10 millilitres de supports de coloration, ajoutez d’abord cinq microlitres de DCFDA à partir d’un stock de 10 millimolaires afin d’obtenir une concentration finale de cinq micromolaires. Bien mélanger en pipetting de haut en bas. Deuxièmement, ajouter cinq microlitres de solution Hoechst à partir d’un stock de 10 milligrammes par mL pour obtenir une concentration finale de cinq microgrammes par mL.
Maintenant, bien mélanger en pipetting de haut en bas. Enfin, ajouter 200 microlitres d’iodure de propidium à partir d’un stock d’un milligramme par mL pour obtenir une concentration finale de 20 microgrammes par mL. Bien mélanger en pipetting de haut en bas.
Maintenant, la solution de coloration est prête à l’emploi. Après trois heures d’incubation après l’exposition aux UVC, retirez les plaques de l’incubateur de CO2. Aspirez les supports de chacun des plats qui ont été exposés à diverses doses d’UVC comme un, 10, 100, 100, 1000, et 10.000 joules par mètre carré.
Maintenant, ajoutez deux millilitres de globules vivants fraîchement préparés à chacun des plats doucement sur les côtés des plats. Remettre les plaques dans l’incubateur de CO2 et incuber pendant 15 minutes pour la coloration cellulaire vivante. Après 15 minutes d’incubation dans le média de coloration des cellules vivantes, retirez les taches de chacun des plats contenant des cellules exposées à différentes doses de rayonnement ultraviolet-C.
Reconstituer les cellules avec deux millilitres de supports complets. Maintenant, les cellules sont prêtes pour la visualisation. Placez maintenant les cellules de contrôle sous le champ lumineux de l’imageur fluorescent.
Les cellules semblent apparemment normales puisqu’il s’agit de cellules de contrôle. Sous le champ bleu, nous pouvons fluorer les cellules totales. Sous le champ vert montre la génération ROS.
Comme il s’agit de cellules de contrôle, il n’y a pas de ROS généré. Sous le champ rouge, les cellules mortes tachées d’iodure de propidium sont visibles. Ensuite, gardez les UV exposés 100 joules par mètre carré sous le champ lumineux.
Sous le champ bleu, et aussi nous pouvons voir le nombre total de cellules sous le champ bleu. Cependant, quand nous exposons au champ vert, des cellules positives de DCFDA sont vues, et également des cellules mortes positives de PI sont vues. Enfin, placez la dose maximale d’UV, c’est-à-dire 10 000 joules par mètre carré de cellules exposées, sous le champ lumineux.
Nous pouvons voir la morphologie cellulaire anormale. Cependant, sous le champ bleu, nous pouvons voir des cellules bleues totales. Sous le champ vert, des cellules positives vertes de fluoration DCFDA sont vues indiquant la génération ros.
Quand les cellules sont exposées au champ rouge, toutes les cellules fluoraient le rouge indiquant un grand nombre de mort cellulaire quand les cellules sont traitées avec 10 000 joules par mètre carré de dosage UV. Maintenant, organisez les images capturées dans différents canaux en un seul panneau d’image composite correspondant aux doses ultraviolettes-C et aux contrôles non exposés. Les images sont disposées en un seul panneau en groupe.
Tout d’abord, le champ lumineux. Deuxièmement, la tache nucléaire bleue hoechst. Troisièmement, la coloration de propidium iodure comme pour les noyaux morts.
Quatrièmement, DCFDA pour les cellules positives ROS. Et cinquièmement, l’image fusionnée. Lorsque nous regardons la première et la deuxième rangée d’images, c’est-à-dire le contrôle non exposé et les cellules exposées à la dose d’UVC d’une joule par mètre carré, nous avons observé qu’il n’y avait ni pi ni cellules positives ROS qui s’étaient allumées, indiquant ainsi une absence totale de ROS et de mort cellulaire dans des contrôles non exposés et une dose uvc si faible d’une joule par mètre carré.
Maintenant à venir à la troisième rangée d’images composites des cellules qui ont été exposés à 100 joules par mètre carré. Un pourcentage très faible de cellules, environ 10%étaient positifs pour PI et DCFDA à cette dose, indiquant ainsi la faible quantité de génération de ROS et la mort cellulaire. Maintenant, nous passons à une autre dose plus élevée d’exposition aux rayons UVC, soit 1000 joules par mètre carré comme indiqué dans la quatrième rangée de l’image composite.
Ici, environ 70% des cellules étaient positives pour pi et DCFDA. Enfin, nous passons à la dose la plus élevée d’exposition aux UVC, soit 10 000 joules par mètre carré comme représenté dans la cinquième rangée de l’image composite. Ici ont été constater que près de 100% des cellules étaient positives pour PI et DCFDA, indiquant ainsi une mort de 100% cellulaire et la génération de ROS à cette dose particulière d’UVC.
Transférez les images vers le logiciel d’imagerie. Ouvrez d’abord l’image bleue indiquant les noyaux tachés hoescht, c’est-à-dire le nombre total de cellules. Ouvrez l’outil de comptage et cliquez sur chacune des cellules une à la fois afin d’avoir le numéro.
Maintenant, ouvrez l’image capturée sous le canal rouge indiquant les cellules mortes positives PI. Ouvrez l’outil de comptage et cliquez sur chacune des taches rouges indiquant le nombre de cellules mortes positives pi. Une fois le comptage des cellules mortes terminé, cliquez sur le canal vert capturé cellules et ouvrez l’outil de comptage et cliquez sur chacun des points verts indiquant les cellules montrant la génération ROS.
Compléter le comptage des cellules vertes capturées sous le canal vert, puis en utilisant la formule énumérer le pourcentage de mort cellulaire par dommages uvc et le pourcentage de production ros par dommages UVC. Ceci est calculé en utilisant le nombre simple de formules de cellules positives pi, c’est-à-dire les cellules fluorescing rouges, divisées par le nombre de cellules positives Hoechst multipliées par 100. Le pourcentage de la production de ROS par dommages aux UV est calculé à l’aide de la formule, du nombre de cellules fluorées positives de la DCFDA ou des cellules fluorées vertes, divisées par le nombre de cellules positives hoechst multipliées par 100.
Une fois que vous avez les deux pourcentages, c’est-à-dire le pourcentage de mortalité cellulaire et le pourcentage de production ros, utilisez ces valeurs pour tracer un graphique à barres. L’axe X indique la posologie des UV, tandis que l’axe Y indique le pourcentage de cellules. Les barres vertes indiquent le pourcentage de génération ROS, tandis que la barre rouge indique le pourcentage de mort cellulaire.
Lors de l’analyse, il est évident qu’à la dose UVC 100 joules il ya 10%ROS cellule génératrice ainsi que d’une mort cellulaire de 10%. Alors qu’à la dose d’UVC 10 portée à trois joules par mètre carré, 70% des cellules présentaient la génération ROS ainsi que la mort cellulaire. Alors qu’à la dose la plus élevée d’UVC, c’est-à-dire 10 augmenté à quatre joules par mètre carré, environ 100% des cellules ont montré la mort cellulaire ainsi que la production ros.
Par conséquent, on peut conclure qu’il existe une forte corrélation positive entre la génération ROS et la mort cellulaire. En conclusion, cette technique est très pratique pour l’évaluation simultanée des espèces réactives d’oxygène, des cellules vivantes et mortes dans la culture vivante et normale d’événement. Cette technique est également utile pour l’évaluation limitée des espèces réactives d’oxygène, des cellules vivantes et mortes, dans les cultures à long terme qui ont été exposées à divers agents endommageant les cellules tels que le rayonnement ultraviolet, ou des agents chimiques.
Et cette technique peut également guider un chercheur pour déterminer le moment optimal pour la récolte des cellules telles que à 50%ROS, 75%ROS, ainsi et ainsi de suite comme il peut y avoir pour de nombreuses applications en aval, telles que QR à PCR et ballonnement occidental.
