Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national des sciences de la santé environnementale [K22ES012264 d&#39;AJRB] et une American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-GRI-00-173-04] pilotes projectaward [à AJRB]. Nous remercions également les membres du laboratoire de l&#39;évêque pour la lecture critique du manuscrit et des commentaires sur la vidéo et Adam Brown, en particulier, pour l&#39;exemple de quoi ne pas faire. Nous remercions le Dr Donald McEwen, de l&#39;Institut Greehey enfants recherche sur le cancer pour nous avoir permis l&#39;utilisation de son champ de dissection / vidéo de la caméra set-up pour le tournage de la vidéo de dissection. Nous remercions Daron Brown à Corte Instruments pour l&#39;affûtage et la réparation de nos outils de microdissection.

1. Enlever les tissus étrangères de l&#39;extérieur de l&#39;œil <ol><li> Verser PBS 1X dans le couvercle d&#39;une boîte de 35mm. Le niveau doit être juste en dessous de la lèvre du couvercle. </li><li> En utilisant des pinces droites, des yeux de transfert (s) du tube de stockage pour le plat de 35mm. Les yeux sont immergés dans du PBS pour deux raisons: 1. Les tissus étrangers seront &quot;flotter&quot; loin de l&#39;œil ainsi vous pouvez voir et de les retirer facilement, et 2. Pendant la dissection, l&#39;œil va naturellement de maintenir sa forme sphérique tout en suspension, vous permettant de travailler avec cette forme plutôt que contre elle. </li><li> L&#39;utilisation des deux paires de pinces à angle (45 ° et 15 °), retirer délicatement le muscle et le tissu conjonctif bien que possible, en tirant le tissu contre le grain (c&#39;est à dire vers la cornée). Certains tissus conjonctifs restera. Un effort devrait être fait pour presser le globe oculaire aussi peu que possible. </li><li> Echangez votre pince à 15 ° pour ciseaux printemps. Tout en tenant l&#39;œil stable avec 45 pinces °, utiliser les ciseaux pour couper le printemps musculaires restantes et des tissus conjonctifs, ainsi que le nerf optique. * Astuce: Utilisez le bord extérieur de la paire de ciseaux pour pousser le tissu contre le grain (vers le fossé cornéo-scléral) et puis découper. Continuez jusqu&#39;à ce que tous les tissus étrangers a été retiré de l&#39;œil. </li></ol> 2. Retirez la cornée et le cristallin <ol><li> Avec la cornée vers le haut, utilisez la pince pour pincer ° 45 jusqu&#39;à un petit pli dans le centre de la cornée. </li><li> En utilisant les ciseaux à ressort, faire une petite incision à la base du lambeau. Lâchez le rabat. </li><li> Tenir les yeux encore avec votre pince, insérez la lame inférieure de ciseaux dans et perpendiculaire à l&#39;incision et faire une coupe vers le fossé cornéo-scléral. Essayez de garder votre lame inférieure sous l&#39;iris afin que les deux de la cornée et l&#39;iris sont coupés. Ne pas couper tout le chemin à la fracture cornéo-scléral. Gardez les ciseaux insérés dans les yeux. </li><li> En utilisant votre pince ° 45, soigneusement tourner de l&#39;œil afin que vos ciseaux sont parallèles à la fracture cornéo-scléral et de faire une petite coupure. Lentement tourner le · Oeil 360, faisant de petites incisions sur tout le pourtour. Encore une fois, essayer de garder la lame inférieure des ciseaux à ressort sous l&#39;iris afin que les deux l&#39;iris et la cornée sont coupés. Soulevez l&#39;iris et la cornée loin du reste de l&#39;œil et les jeter. </li><li> Inclinez l&#39;œil sur son côté et appuyez doucement sur la moitié postérieure de l&#39;œil, ce qui oblige le cristallin à. Jeter de la lentille. L&#39;intérieur de l&#39;œilleton restante est bordée par la rétine neurale, ce qui devrait look lisse et opaque. </li></ol> 3. Trimestre de l&#39;œilleton résultant, résultant en un 4 - &quot;pétales&quot;, fleur-comme la structure <ol><li> L&#39;œil doit être positionné de telle sorte que l&#39;ouverture de l&#39;œilleton est perpendiculaire à votre corps. Utilisez votre pince ° 45 à la régulière et la position de l&#39;œilleton. </li><li> Tenir vos ciseaux à ressort en face de vous afin qu&#39;ils soient perpendiculaires à votre corps, insérer la lame inférieure des ciseaux à ressort dans le bord supérieur de la coupe à yeux ouverts. En utilisant votre pince à 45 °, aligner soigneusement la tasse oeil de sorte qu&#39;un seul, coupe droite peut être faite de la fracture cornéo-scléral vers la tête du nerf optique. Toutes les coupes doivent être perpendiculaires à la fracture cornéo-scléral et sauf indication contraire, doit aller au plus près à la tête du nerf optique que possible sans couper dedans. </li><li> Tournez l&#39;œilleton de 180 °, en maintenant sa perpendicularité avec votre corps. Utiliser une technique à l&#39;étape 3.2 pour faire une coupe perpendiculaire secondes. </li><li> Tournez l&#39;œilleton et répéter la technique décrite au paragraphe 3.2 de faire deux coupes plus. Les quatre coupes devraient être aussi proche de 90 ° que possible. Gardez à l&#39;esprit que l&#39;œil n&#39;est pas parfaitement sphérique il y aura donc une certaine variabilité. </li></ol> 4. Couper chacun des quatre «pétales» de moitié, résultant en une à huit pétales de fleur-comme la structure <ol><li> Transfert l&#39;œilleton quartiers de l&#39;antenne de 35mm sur une lame propre. Avec l&#39;œilleton vers le haut, scoop dessous avec les 45 pince °. Soigneusement le sortir du liquide et le placer sur une lame propre. </li><li> L&#39;utilisation des deux paires de pinces à angle, ouvrir doucement sur l&#39;oeil, avec la rétine neurale vers le haut. NE PAS RETIRER LA RÉTINE NEURONES-il aide l&#39;œil maintenir certaines de sa forme sphérique de sorte que vous ne travaillez pas contre elle. Elle protège également l&#39;EPR d&#39;être accidentellement endommagés dans les procédures suivantes. </li><li> Tournez le glisser jusqu&#39;à l&#39;un des pétales est perpendiculaire à votre corps. </li><li> Utilisez votre pince à 15 °, délicatement attraper au coin de la pétale. Le coin du pétale doit être cornée, rétine neurale pas ou RPE. Soulevez délicatement sur le coin, lui permettant de conserver sa courbure. </li><li> Insérez la lame en bas de votre paire de ciseaux à ressort entre les pétales et la diapositive. Alignez vos ciseaux de telle sorte qu&#39;une seule, droite, coupe perpendiculaire peut être faite de la fracture cornéo-scléral vers la tête du nerf optique. Coupez le plus près de la tête du nerf optique que withou possiblest de coupe dedans. Lâchez le pétale, lui permettant de se coucher sur la diapositive. </li><li> Tournez la lame à 90 °, de sorte que le pétale suivant est perpendiculaire à votre corps. Répétez l&#39;étape 4.5. </li><li> Répétez les étapes 4,5 et 4,6 fois plus. La structure résultante devrait ressembler à une fleur à huit pétales. </li></ol> 5. Retirez la rétine neurale <ol><li> Pipeter 100 à 200 ul de PBS 1X sur le spécimen. Cela permettra d&#39;éviter la rétine neurale de coller comme vous le retirer de l&#39;EPR. </li><li> Typiquement la rétine neurale est lâchement attaché à l&#39;EPR. Toutefois, il ne prendra la pratique et l&#39;habileté de ne supprimer que la rétine neurale et non l&#39;EPR. Saisir délicatement un pétale de la rétine neuronale avec une paire de pince à angle tout en stabilisant (maintenant) le reste de l&#39;œil avec l&#39;autre paire de pince coudée. Tirez sur la rétine neurale loin du reste de l&#39;œil. Continuez cette procédure jusqu&#39;à ce que la rétine entière de neurones a été supprimée. * Astuce: coller le bout de votre pince à 15 ° dans la tête du nerf optique d&#39;ancrer l&#39;œil. Ensuite, utilisez la pince à 45 ° pour balayer sous la rétine neuronale et l&#39;enlever et de loin. Il est généralement préférable de soulever la rétine neurale de la tête du nerf optique vers le fossé cornéo-scléral. Soyez sûr de détacher les restes lâche de l&#39;iris. L&#39;iris est assez collante et peut par ailleurs se coincer à l&#39;EPR. </li><li> Rincer l&#39;éprouvette avec du PBS 1X. Pipeter 100 à 200 ul de PBS 1X dans l&#39;échantillon et le sucer sauvegarder. Jeter le PBS. Répéter au besoin pour enlever la poussière et les débris. </li></ol> 6. Mont-vous spécimen (s) sur une lame <ol><li> Pipeter 80 à 90 uL de glycérol 90% sur une nouvelle diapositive dans une forme rectangulaire. Utilisez le côté de la pointe de la pipette pour faire une même frottis rectangulaire de glycérol. (Ceci est la procédure à suivre pour le montage de deux EPR sur une diapositive.) </li><li> Insérez le bras inférieur de 15 ° sous une pince le spécimen. Soulevez doucement le spécimen de la lame de dissection. </li><li> Abaissez doucement le spécimen dans la glycérine. Doucement bouger la pince que vous les sortez de sous le spécimen. </li><li> Répétez les étapes 6.1 à 6.3 pour l&#39;autre spécimen. </li><li> Tourner la lame de sorte que le côté le plus long est perpendiculaire à votre corps. Tenez votre couvercle en verre à un angle de 45 ° à la diapositive de sorte qu&#39;il est de toucher la lame. Déplacez-le vers le frottis de glycérol jusqu&#39;à ce qu&#39;ils touchent. Maintenir le contact entre le couvercle en verre et faire glisser, déplacer lentement le couvercle en verre loin de la diffamation, vers le bord de la diapositive. Alignez les côtés de la lame et le couvercle en verre afin qu&#39;elles soient parallèles. Tenez les coins de la vitre couvercle entre le pouce et l&#39;index. </li><li> Ramassez la pince 15 ° dans l&#39;autre main. Berceau de la partie supérieure (gratuit) bord du verre de couverture dans le creux du bras. Très lentement, baissez le couvercle en verre. Lorsqu&#39;un contact est établi entre le couvercle en verre et le glycérol, s&#39;arrêter et attendre pour le glycérol pour migrer. Répétez cette descente et attendre les monts RPE entiers sont entièrement couverts. Ceci, pour éviter le glycérol très visqueux de la capture de bulles d&#39;air. NE PAS pousser sur la lamelle - le glycérol sera squeeze out de dessous, ce qui rend l&#39;adhérence très faible. </li><li> Avec vernis à ongles transparent, peinture sur le périmètre où le couvercle en verre et faites glisser rencontrer. </li><li> Placer la lame sur le dessus d&#39;un rack vide à sec. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Le résultat de cette procédure doit être une structure qui ressemble à une fleur et devrait être assez symétrique. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Whole EPR de montage d&#39;une souris de type sauvage C67Bl/6J. RPE du noir ou des animaux agouti doit être de couleur brun foncé et doit avoir une surface lisse. Il est normal de constater des ondulations dans la topographie des pétales. La pigmentation sur tout spécimen donnent peut-être quelque peu variable, en raison de la densité variable de la pigmentation des deux EPR et la choroïde sous-jacente. Les flèches blanches point à hypopigmentées «canaux» - ce qui est normal et est dû à la vascularisation sous-jacente de l&#39;œil. Flèche bleue à des dommages physiques à la fois à l&#39;EPR et la choroïde sous-jacente. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Whole EPR de montage d&#39;une souris diluer. Spécimens récoltés à partir d&#39;animaux peut diluer la couleur va du presque transparent au café au lait et tout spécimen ci est comme avoir une variabilité au sein, avait indiqué dans les cercles noirs ici. En général, les RPE récoltés à partir des animaux plus jeunes sont plus légers et ceux récoltés provenant d&#39;animaux âgés sont plus sombres. Les flèches noires indiquent certains de la vascularisation sous-jacente, qui apparaît hypopigmentées. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Phalloïdine coloration peut être utilisée pour détecter des dommages physiques à l&#39;EPR. Coloration phalloïdine expose clairement les membranes cellulaires, montrant la forme hexagonale de l&#39;épithélium. (A) Exemple d&#39;une souris noire. (B) Exemple d&#39;une souris diluer. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Un EPR mal disséqué d&#39;une souris diluer. (A) Les parenthèses indiquent les marges de la cornée qui sont trop larges, ce qui peut provoquer le flambement et / ou de pliage. Dans le cercle noir que vous pouvez voir des quantités excessives de tissu étranger qui n&#39;ont pas été retirés de l&#39;arrière de l&#39;œil. Ils sont particulièrement évidentes car l&#39;échantillon est d&#39;un animal diluer. Le pétale en bas à gauche est partiellement repliée. (B) Ce support a toute l&#39;apparence d&#39;un moulinet. Les flèches noires indiquent certaines des réductions qui ont été faites. Beaucoup de coupures de la fracture cornéo-scléral vers la tête du nerf optique ne sont pas en conformité avec le diamètre. (C) Les flèches noires indiquent la manière dont les coupes devraient avoir été faites, en ligne avec le diamètre et la perpendiculaire à la tangente.

<ol>
	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

L&#39;EPR est le site de l&#39;essai p de l&#39;ONU, un essai in vivo d&#39;homologie dirigée réparation. Le dosage de l&#39;ONU p a été utilisé pour étudier les effets des dommages d&#39;ADN différentes 1,2 et de signalisation des dommages de l&#39;ADN et les gènes de réparation 3,4,5 sur la fréquence d&#39;homologie dirigée réparation. Ce test est très sensible, en détectant une seule cellule événements sur l&#39;EPR 1. Il peut aussi détecter des différences dans le calendrier d&#39;homologie-dirigé les événements de réparation au cours du développement 6. L&#39;œil murin développe radialement vers l&#39;extérieur du nerf optique 7 et donc, la distance relative des événements de la tête du nerf optique est corrélée à l&#39;époque dans le développement de leur perpétration. L&#39;EPR est aussi d&#39;intérêt pour ceux qui étudient le développement rétinienne ou maladies de la rétine. Bien que les cellules RPE peuvent être cultivées, il ya des limites importantes à faire. Adulte cellules de l&#39;EPR sont post-mitotiques 7 et prévisible ne prolifèrent pas bien in vitro. Par ailleurs, les cultures qui poussent montrent de nombreuses modifications, y compris mais non limité à des changements dans la pigmentation, la morphologie et jonctions cellulaires 8 - quelques-unes des caractéristiques qui font l&#39;objet de l&#39;investigation scientifique. Par conséquent, la préparation d&#39;une monture ensemble de l&#39;EPR est une technique pertinente pour les études in vivo sur le développement et les maladies de l&#39;œil. Dissection de ce tissu est très délicat petites au premier abord. Il est important d&#39;être détendu et de maintenir la bonne posture et de positionnement comme indiqué dans cet article la vidéo. Si l&#39;ensemble de montage EPR ressemble à un moulinet, c&#39;est parce que les coupes longues n&#39;ont pas été faites en conformité avec le diamètre, c&#39;est à dire pas perpendiculaire à une tangente. Ceci est plus susceptible de se produire lorsque les ciseaux ne sont pas tenus devant et perpendiculairement loin du corps. Une apparence déchiquetée aux coupures longues est vraisemblablement dû à un léger retrait des lames de ciseaux entre les coupes. Une apparence rugueuse ou accidentée à la surface de l&#39;EPR n&#39;est pas normal et pourrait être due aux dommages causés par une manipulation brutale de l&#39;éprouvette. Les dommages peuvent être vérifiées à l&#39;aide coloration phalloïdine. Taches blanches ou claires sont des trous dans l&#39;EPR et la choroïde sous-jacente, également causée par une manipulation brutale ou la perforation. Si l&#39;EPR semble rugueux et opaque, ceci est probablement dû à des restes de la rétine neurale. Cela peut se produire si les yeux sont sous-ou sur-fixe (moins de 2 heures, plus de 4 heures dans 4% PFA). Cela peut également se produire dans les yeux bien fixés qui ont été entreposées pendant une période de temps excessive (&gt; 6 mois). Le traitement Dispase peut être utilisé pour retirer ces restes, mais peut aussi causer l&#39;EPR à se briser. Détection des dommages physiques à l&#39;EPR est très difficile dans des échantillons dilués ou albinos. Nous vous recommandons d&#39;utiliser coloration phalloïdine sur votre dissections début afin que vous puissiez voir les dommages qui auraient pu survenir en raison de la manipulation. Pour ce faire, bloc pendant 1 heure avec 200 pl de BSA 2% en 1XPBS dans un tube de centrifugeuse micro. Ensuite, ajoutez phalloïdine 2μL et incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Puis laver 3x avec 1 ml de 1XPBS pendant 30 minutes chacune à la température ambiante dans l&#39;obscurité. Mont diapositives comme d&#39;habitude. * Remarque: la tache est très lumineux et nous ne recommandons pas d&#39;utiliser flouramount ou similaire fluorescence de préservation des médias. Malgré toutes les mises en garde, un EPR toute monture n&#39;est pas très délicat et peut facilement résister aux manipulations nécessaires pour effectuer la dissection, la coloration, l&#39;immunohistochimie ou immunofluorescence.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

L&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) se trouve à l&#39;arrière de l&#39;œil chez les mammifères, juste sous la rétine neurale, qui contient les photorécepteurs (cônes et bâtonnets). L&#39;EPR est une monocouche de cellules cubiques pigmentaires et associés étroitement avec la rétine neurale juste au dessus. Cette association fait l&#39;EPR de grand intérêt pour les chercheurs qui étudient les maladies rétiniennes. L&#39;EPR est aussi le site d&#39;un essai in vivo d&#39;homologie dirigée réparation de l&#39;ADN, le test p ONU. L&#39;oeil de la souris est particulièrement difficile de disséquer en raison de sa petite taille (environ 3,5 mm de diamètre) et sa forme sphérique. Cet article montre en détail une procédure pour la dissection de l&#39;œil entraînant une monture ensemble de l&#39;EPR. Dans cette procédure, nous montrons comment travailler avec, plutôt que contre, la structure sphérique de l&#39;œil. En bref, le tissu conjonctif, des muscles et du nerf optique sont retirés du fond de l&#39;œil. Ensuite, la cornée et le cristallin sont supprimés. Ensuite, coupures stratégiques sont prises qui aboutissent à un aplatissement significatif du tissu restant. Enfin, la rétine neurale est délicatement soulevé, révélant une RPE intacte, ce qui est encore attaché à la choroïde sous-jacente et la sclère. Ce support entière peut être utilisé pour effectuer le test p ONU ou de l&#39;évaluation immunohistochimie ou immunofluorescence du tissu EPR.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Une démonstration formelle de la dissection d&#39;un oeil de la souris, résultant en une monture ensemble de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien.

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.2K vues.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. Une démonstration formelle de la dissection d'un oeil de la souris, résultant en une monture ensemble de l'épithélium pigmentaire rétinien.

Vidéo: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Modèles expérimentaux pour l&#39;étude de la physiologie épithélium pigmentaire rétinien et physiopathologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Recherche

Neurosciences

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Préparation Mont entiers de l&#39;Adulte Drosophile Chaîne nerveuse ventrale pour injection fibre Dye Géant

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

La cornée micropoche test: Un modèle de l&#39;angiogenèse dans l&#39;oeil de la souris

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbal injection Approche-sous-rétinienne de vecteurs viraux pour la thérapie génique chez la souris épithélium pigmentaire rétinien

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.