Cette méthode peut être utilisée pour évaluer in vitro la toxicité de nouvelles formulations de produits ophtalmiques. En affinant les concentrations de produits chimiques et de formulations de produits à l’aide de cellules oculaires in vitro, l’utilisation d’animaux pour évaluer l’innocuité de nouveaux produits peut être minimisée. Les essais in vitro évaluent les paramètres de toxicité qui ne peuvent pas être évalués in vivo, comme la détermination de l’effet d’un produit chimique sur la fonction mitochondriale, l’intégrité de la membrane cellulaire et l’activité enzymatique.
Évaluer la toxicité cellulaire in vitro est essentiel pour comprendre les mécanismes potentiels de toxicité. Ceci est essentiel pour établir une dose maximale tolérable de produits chimiques thérapeutiques dans l’œil. Nijani Nagaarudkumaran, un chercheur du Jones Laboratory, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par placer les HCECs et les iHCEC sur des boîtes de Petri recouvertes de collagène avec des couvercles inférieurs en verre à une concentration de 1 x 10 à la 5ème avec 1 millilitre de milieu épithélium oculaire humain, ou HOEM. Cultiver des pHCEC et des iHCEC 1 ensemble de cultures pendant 24 heures et un autre ensemble pendant 48 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après incubation, colorer les cellules avec 500 microlitres de solution tampon de coloration à l’annexine contenant 4 calcéines micromolaires, 8 micromolaires d’homodimère d’éthidium 1 et d’annexine 5 pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.
Après avoir coloré les cellules, ajustez le microscope confocale à balayage laser pour capturer les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, comme décrit dans le manuscrit. Obtenez les images bidimensionnelles et tridimensionnelles en suivant les instructions du manuscrit. Ensemencer les cellules à 5 x 10 à 4 par millilitre de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture recouverte de collagène 1 à 24 puits et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 3 heures.
Après l’incubation, réduisez le volume du milieu dans les puits à 300 microlitres. Ensuite, exposez les cellules au rayonnement UVA à 6,48 watts par mètre carré et au rayonnement UVB à 1,82 watt par mètre carré à 37 degrés Celsius pendant 5 et 20 minutes dans des expériences séparées. Après rayonnement UV, ajoutez 200 microlitres de HOEM frais à chaque puits et incuber pendant 20 heures à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone à 5%.
Le lendemain, récupérez le surnageant cellulaire dans chaque puits et transférez-le dans des tubes stériles en polypropylène de 2 millilitres. Congeler le surnageant à moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer les niveaux de cytokines libérés par les HCECs et les iHCEC après une exposition aux UV, utilisez un test de cytokines multiplex et suivez les instructions du kit pour quantifier l’interleukine 6, l’interleukine 8, l’interleukine-1 bêta et le TNF-alpha.
Préparer le réactif de dosage métabolique à 10% dans DMEM et F12. Remplacer le milieu de culture dans chaque puits par 1 millilitre de la solution de dosage métabolique à 10% et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 4 heures. Mesurer la fluorescence de chaque solution à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes à 530 nanomètres d’excitation et 590 nanomètres d’émission longueurs d’onde.
Cellules de semence à 5 x 10 à la quatrième par millilitre de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture enrobée de collagène 1 à 24 puits. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 3 heures. Après l’incubation, retirez le milieu et exposez les cellules à 1 millilitre de toxines chimiques, dont 0,001% de chlorure de benzalkonium, ou BAK, 0,01% de peroxyde d’hydrogène et 0,0025% de dodécylsulfate de sodium dans du PBS pendant 5 et 15 minutes.
Après l’exposition aux toxines chimiques, retirez les toxines des puits, rincez avec 1 millilitre de PBS et ajoutez 1 millilitre de HOEM à chaque puits. Après 20 heures d’incubation, effectuer un essai métabolique en remplaçant le milieu par 1 millilitre d’une solution de dosage métabolique à 10 % et en incubant à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 4 heures. Mesurer la fluorescence de chaque solution à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes à une excitation de 530 nanomètres et à des longueurs d’onde d’émission de 590 nanomètres.
Transférer les surnageants cellulaires des puits après l’incubation de 20 heures dans des tubes en polypropylène stériles séparés de 2 millilitres et les congeler à moins 80 degrés Celsius. Utilisez la même plateforme multiplex utilisée pour évaluer les cytokines des cellules traitées aux UV en suivant les instructions du kit pour quantifier l’interleukine 6, l’interleukine 8, l’interleukine-1 bêta et le TNF-alpha. Les cellules de graine à 1 x 10 à 5e par millilitre de HOEM dans chaque puits d’une plaque de culture recouverte de collagène 1 à 24 puits et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.
Après l’incubation, retirez le milieu et exposez les cellules à 1 millilitre de toxines chimiques, dont 0,001% BAK, 0,005% BAK et 0,01% BAK dans PBS pendant 5 minutes. Après l’exposition, éliminez les toxines chimiques, rincez les puits avec 1 millilitre de PBS et ajoutez 1 millilitre de HOEM à chaque puits. Après 20 heures d’incubation, colorer les cellules avec 500 microlitres de solution tampon de coloration d’annexine contenant de la calcéine, de l’homodimère d’éthidium et de l’annexine 5 pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.
Ajuster le microscope pour mesurer les intensités aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 630 et 675 nanomètres pour l’annexine 5, 495 et 515 nanomètres pour la calcéine AM, et 528 et 617 nanomètres pour la coloration à l’éthidium 1. Acquérir ensuite des images des cellules à l’aide du microscope à fluorescence. Les HCEC se sont avérés être de petites cellules allant de 10 à 20 micromètres et les HCEC étaient de l’ordre de 20 à 50 micromètres après 24 heures de croissance.
Des différences similaires dans la gamme de taille ont été observées pour les CSEi et les CSEp après 48 heures de croissance. Par rapport aux cellules non exposées aux UV, l’activité métabolique des HCEC irradiés a été considérablement réduite après 20 minutes d’exposition. Pour les HCEC, l’activité métabolique a diminué pour les cellules irradiées à la fois à 5 et 20 minutes.
Par conséquent, il a fallu un temps d’exposition plus long pour réduire l’activité métabolique des HCEC que des HCECi. La libération maximale de cytokines par les HCEC a été de 5 minutes d’exposition aux UV. La libération maximale de cytokines pour les HCECs s’est produite après 20 minutes d’exposition aux UV.
En termes de quantités totales de cytokines inflammatoires libérées, les CSEp ont libéré beaucoup plus d’interleukine-1 bêta, d’interleukine 8 et de TNF-alpha que les HCECi, tandis que les HCECs ont libéré plus d’interleukine 6. Les CSEp et les HCECs ont montré un changement dans la libération d’interleukine 6 après exposition aux trois produits chimiques. BAK a entraîné une diminution de la libération d’interleukine 6 par rapport au contrôle pour les CSHC primaires et immortalisés.
Le peroxyde d’hydrogène a entraîné une augmentation des rejets d’interleukine 6 par les CSHCi et une diminution des rejets de HCEC. Les HCECs et les CSEi ont été significativement endommagés à 0,005 % et 0,1 % des BAK. Après avoir effectué des évaluations in vitro de la toxicité des cellules oculaires, d’autres modèles animaux de toxicité oculaire pourraient être entrepris pour déterminer l’effet d’un produit oculaire sur les nerfs cornéens ou le système immunitaire oculaire.
Ces techniques sont essentielles pour déterminer les mécanismes de toxicité des produits chimiques et de la formulation des produits sur l’œil et aideront à minimiser l’utilisation des animaux pour les essais de développement de produits.
