L’objectif global de ce protocole est de démontrer comment combiner l’utilisation de micro fluidiques avec des tableaux de micro-électrodes pour générer la plate-forme adaptée à l’étude de la communication neuronale et de la propagation du signal axonal. Bonjour, je suis Paulo Aguiar et je suis l’IP du Neuro engineering and Computation Neuroscience Lab à l’INEB, utilisé pour coder pour le génie biomédical à l’Université de Porto, Portugal. Comprendre la transmission de l’information dans les circuits neurologiques demeure l’un des plus grands défis en neurosciences.
Aujourd’hui, je vais vous montrer comment nous pouvons combiner des tableaux de micro-actionneurs individuels avec des micro fluidiques et des outils logiciels développés ici à notre laboratoire, pour détecter et caractériser les potentiels d’action de propagation. Nous utilisons cette configuration dans une variété d’études, à savoir le codage neuronal et le décodage, et dans les communications entre les neurones sensoriels et d’autres types de cellules. Nous croyons que la démonstration visuelle de ce protocole est cruciale.
Étant donné que l’assemblage de tableaux micro fluidiques et micro-électrodes est cette difficulté à gérer, et difficile à reproduire simplement en reproduisant des protocoles. Pour le marché, les ventes cultary sur cette plate-forme n’est pas simple, comme les ABA conventionnelles, et il exige une attention particulière à la cellule assis trucs, et les aimants de culture. Cette configuration nous permet d’étudier plusieurs propriétés liées à la communication, telles que la vitesse de propagation et la direction, dans un environnement bien contrôlé.
Bien que la procédure d’enregistrement soit simple, l’analyse des données nécessite des connaissances et l’utilisation des bons outils informatiques. La veille de la séance cellulaire, commencez par préparer les dispositifs micro fluidiques, en nettoyant avec du ruban vinyle. Appuyez doucement sur la bande contre l’appareil pour atteindre toutes les zones du micro fluidique.
Le plasma d’air nettoie l’AAM pendant trois minutes pour nettoyer la surface et la rendre plus hydrophile. À l’intérieur d’une hotte d’écoulement laminaire, submergez les micro fluidiques dans 70 pour cent d’éthanol. Laissez-les sécher à l’air libre.
Placer chaque MEA dans une boîte de Pétri et stériliser par 15 minutes d’exposition à la lumière UV. Ensuite, rendez-vous dans la zone centrale de l’AE AVEC 500 microlitres de solution de l’Î.-P.-É. Incuber pendant au moins une heure.
À l’intérieur d’une hotte d’écoulement laminaire, aspirez la solution de revêtement de l’Île-du-Prince-Édouard à partir de la surface mea. Ensuite, lavez les MEA quatre fois avec un millilitre d’eau stérile. À l’aide d’un microscope stérile, placé à l’intérieur du capot d’écoulement laminaire.
Centrez la puce MEA et ajoutez un millilitre d’eau stérile à la zone centrale de l’AE. Ensuite, placez le dispositif micro fluidique sur le dessus de la surface MEA, et alignez soigneusement la grille micro-active microgrooves de l’AAM. Aspirer l’eau excessive, et incuber toute la nuit à 37 degrés, pour permettre un attachement complet.
Le lendemain, chargez les puits de laminine et incubez à nouveau. Après avoir recueilli les susseds d’embryon, procéder à la dissection préfrontale de cortex. Commencez par exposer soigneusement le cerveau, à l’aide d’une paire de forceps.
Ensuite, retirez doucement le cerveau de sa cavité. Couvrez-le de H-HBSS froid. Lorsqu’elles sont présentes, retirer et jeter les bulbes olfactifs.
Enfin, disséquer le cortex préfrontal. Assurer l’enlèvement complet des méninges. Répétez cette procédure pour les deux hémisphères.
Pour le nombre de cerveaux requis pour votre étude. À l’intérieur d’une hotte d’écoulement laminaire, recueillir les fragments de cortex précédemment disséqués dans un total de cinq millilitres de H-HBSS. Ensuite, transférez ces fragments dans un tube chronique stérile de 15 millilitres.
Pipette, et ont 2,3 millilitres de solution trypsine fraîchement préparée au tube contenant les fragments du cortex. Mélanger la suspension et incuber à 37 degrés pendant 15 minutes. Agiter toutes les cinq minutes.
Ensuite, jetez le supernatant contenant la trypsine, ajoutez H-HBSS contenant FBS, pour inactiver la trypsine restante. Agiter doucement. Laissez les fragments du cortex s’installer et jetez le surnatant.
Lavez-le deux fois avec H-HBSS, pour enlever le FBS, et jetez le supernatant à nouveau. Ajouter le milieu basal neural complété, et dissocier mécaniquement les tissus en pipetting lentement de haut en bas. Jeter le reste du tissu en filtrant la suspension de sel à travers une passoire cellulaire.
Ensuite, mélangez 20 microlitres de suspension cellulaire avec 20 microlitres de bleu trypan. Transférez 10 microlitres dans une chambre Neubauer et comptez le nombre de cellules viables. Immédiatement avant la cellule assise, retirer la laminine de tous les puits du micro EF. Ensuite, ajoutez le petit volume de milieu supernatant à chaque puits du compartiment axonal.
Ensemencer lentement cinq microlitres de suspension cellulaire dans le compartiment somal. Incuber à 37 degrés pendant une heure pour permettre l’attachement cellulaire au substrat. Après une heure, remplir délicatement chaque puits avec un milieu chaud et complété.
Ajouter de petits volumes pour éviter le décollement cellulaire. Ensuite, transférez le micro EF dans un incubateur. Voici montré une culture à cinq jours in vitro.
Après une semaine, les cultures commencent à montrer une activité spontanée. Avant d’effectuer des enregistrements, utilisez un contrôleur de température pour manger la plaque de base d’incendie pré-ampli. Ensuite, placez le micro EF sur le préampli, fermez et verrouiller le couvercle.
Pour enregistrer, ouvrez le logiciel expérimental multicanal. Réglez le taux d’échantillonnage à 20 kilohertz. Faites glisser le filtre et les boîtes enregistrées, et connectez-les séquentiellement pour enregistrer les données brutes et filtrées.
Commencez l’acquisition de données pour visualiser les signaux, et enregistrez rapidement. Les données enregistrées peuvent être rapidement explorées à l’aide de l’analyseur multicanal. Ici, la propagation du signal le long des microgrooves est déjà claire.
Pour identifier et caractériser ces événements de propagation, ouvrez votre enregistrement en chasseur de micro pointes. Cliquez sur le bouton info fichier pour accéder aux paramètres d’enregistrement et sélectionnez l’ensemble des micro-électrodes pour analyse. Fixez le seuil de propagation de la détection d’événements.
Et lisez rapidement les données. Le logiciel énumére toutes les séquences détectées. L’utilisateur peut alors évaluer la vitesse de propagation comme information, entre les paires de micro-électrodes, et en fonction de leur corrélation inter-distance et croisée.
L’outil graphique de chimio permet à l’utilisateur d’estimer manuellement la vitesse de propagation. Voici un événement de propagation. Détecté le long de quatre micro-électrodes dans un microgroove.
Ces événements peuvent être représentés dans une parcelle Rasser. Voici l’activité de propagation le long de 11 microgrooves pour les deux premières minutes de l’enregistrement. Les microgroove à haute et basse activité sont colorés en jaune et rouge, respectueusement.
Remarquez la synchronisation de l’activité le long des 11 microgrooves. La synchronisation est indépendante du taux d’activité. Comme on peut le voir dans les variations de la vitesse de cuisson instantanée des deux microgrooves.
Les microgrooves fonctionnent également comme amplificateurs de signaux axonals, comme le montrent la boîte et l’intrigue des moustaches. Nous vous avons montré comment combiner les micro fluidiques avec les MEA, et comment la culture des neurones sur eux. En outre, comment enregistrer et extraire des données significatives de ces enregistrements.
Nous espérons que cette démonstration sera utile pour vos recherches, pourquoi vous voudrez peut-être étudier la communication dans les circuits neuronaux.
