Ce protocole a introduit une méthode définie sans cellule d’alimentation pour différecier les cellules souches épithéliales limbales cornéeles des cellules souches pluripotentes humaines. Les cellules souches épithéliales limbales sont responsables du renouvellement de l’épithélial cornéen dans l’œil sain. Les dommages à ces cellules mènent à une condition connue sous le nom d’insuffisance limbale de cellules souches, et à la perte de clarté cornéenne.
Les méthodes de culture cellulaire présentées ici permettent une production efficace de cellules souches épithéliales limbales pour les futures thérapies de remplacement des cellules cornéeles. Pour commencer, passer et maintenir la culture de cellules souches pluripotentes humaines libres comme décrit dans le protocole de texte. Assurez-vous d’utiliser uniquement des cellules souches pluripotentes humaines de haute qualité comme matériau de départ pour les différenciations.
Lorsqu’il est prêt à induire la formation du corps embryoïde, réchauffer tous les matériaux nécessaires et les reagents à la température ambiante dans une hotte d’écoulement laminaire. Détachez les cellules souches pluripotentes humaines libres de la mangeoire à la suspension en ajoutant 500 microlitres de trypsine libre xéno EDTA à chaque puits. Une incubation à 37 degrés Celsius, avec 5% de CO2.
Après trois minutes, retirez les cellules de l’incubateur et vérifiez la morphologie cellulaire pour déterminer la phase optimale pour l’ablation de la trypsine. Observez attentivement les cellules pour déterminer le moment optimal pour enlever l’EDTA sans tryspin xeno, lorsque les cellules se sont arrondies, mais ne se sont pas détachées complètement. Au moment optimal, retirez la trypsine xéno libre EDTA des cellules.
Ajouter l’inhibiteur défini de la trypsine et la pipette doucement pour détacher les cellules. Recueillir la suspension à cellule unique dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Centrifugeuse à 300g pendant cinq minutes.
Ensuite, retirez le surnatant et resuspendez les cellules en un millilitre de milieu de culture. Après compter les cellules, distribuer deux à trois millions de cellules en trois millilitres de milieu d’induction basale complété par cinq blebbistatin micromolaire à chaque puits d’un faible attachement six plaque de puits. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.
Le lendemain, vérifiez la qualité des corps embryoïdes au microscope. Retirez le milieu et remplacez-le par trois millilitres de milieu d’induction basale complétés par 10 micromolaires SB-505124 et 50 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance de fibre de verre de base humain. Continuer à couver à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.
Les deux jours suivants, retirez le milieu et remplacez-le par trois millilitres de milieu d’induction basale, complétés par 25 nanogrammes par millilitre de protéine morphogénétique osseuse quatre. Ensuite, continuez l’incubation en utilisant les conditions précédentes. Le quatrième jour, préparer un mélange de 0,5 microgramme par centimètre carré de Laminin-521, et cinq microgrammes par centimètre carré de collagène placentaire humain de type quatre, dilué dans DPBS contenant du calcium deux et du magnésium deux ions.
À l’aide de ce mélange, enrober les plats de culture tissulaire de 100 millimètres pour une différenciation adhérente dans un volume total de revêtement de cinq millilitres par plat. Sceller les plaques et les conserver à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le cinquième jour, réchauffer tous les matériaux et les réacoleurs nécessaires à température ambiante dans un capot d’écoulement laminaire.
Après cela, retirez la solution de revêtement et ajoutez 10 millilitres de différenciation préchauffée moyenne à chaque plat. À l’aide d’une pipette, transférer les corps embryoïdes d’une seule plaque à travers deux à trois plats de culture tissulaire. Ensuite, secouez doucement chaque plat de culture pour répartir uniformément les corps embryoïdes.
Maintenir les cellules en culture adhérente à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 pour les deux prochaines semaines et demie à trois semaines, en s’assurant de remplacer le milieu par 10 millilitres de milieu de différenciation frais trois fois par semaine. Utilisez un microscope à contraste de phase pour vérifier régulièrement les cellules pour l’émergence d’une morphologie épithéliale correcte. Pour commencer, préchauffer tous les matériaux et les réamen nécessaires à la température ambiante dans un capot d’écoulement laminaire, à l’exception du milieu de cryopréservation, qui doit être pré-refroidi.
Ensuite, détachez les cellules souches pluripotentes humaines dérivées des cellules souches épithéliales limbales à la suspension d’une seule cellule en ajoutant de la trypsine EDTA sans xéno et en couveant à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Après cinq minutes, retirez les cellules de l’incubateur et vérifiez la morphologie cellulaire pour déterminer la phase optimale pour l’ablation de la trypsine. Observez attentivement les cellules pour déterminer le moment optimal pour enlever la trypsine libre xéno EDTA, lorsque les cellules se sont arrondies, mais ne se sont pas détachées complètement.
Au moment optimal, retirez la trypsine libre xéno EDTA des cellules, et détachez les cellules comme décrit précédemment. Après avoir compté les cellules, centrifugez-les à 300g pendant cinq minutes. Aspirez le milieu et réutilisez les cellules dans un milieu de cryopréservation libre xéno pré-refroidi.
À l’aide d’une pipette, transférer la suspension à cellule unique en cryo-tubes pour que chaque cryo-tube contienne entre 500 000 et un million de cellules dans un millilitre de milieu de cryopréservation. Placer les tubes dans un contenant de congélation. Dans les cinq minutes, les transférer dans un congélateur à 80 degrés Celsius négatifs pour l’entreposage pendant la nuit.
Le lendemain, transférer les tubes dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Avant de décongeler les cellules, enrober tous les plats et puits d’assiette nécessaires d’un mélange de cinq microgrammes par centimètre carré de collagène placentaire humain de type quatre, et de 0,5 microgramme par centimètre carré de LM-521, et préchauffer tous les matériaux et réagencés nécessaires à la température ambiante dans le capot d’écoulement laminaire. Ensuite, retirez la solution de revêtement des plats et des puits d’assiette et ajoutez le volume approprié de milieu de différenciation préchauffé.
Ajouter le milieu de différenciation préchauffé à un tube conique de 15 millilitres. Décongeler les cellules rapidement à température ambiante. Une fois décongelée, transférer immédiatement la suspension cellulaire dans le tube de centrifugeuse conique.
Centrifugeuse à 300g pendant cinq minutes. Aspirer le milieu, et résusquer la pastille cellulaire dans le milieu de différenciation pour enlever n’importe quel milieu de cryopréservation. Plaquez les cellules sur des plats précoated dans le milieu de différenciation à une densité de 40.000 à 50.000 cellules par centimètre carré.
Maintenir les cellules à 37 degrés Celsius à 5% de CO2, en remplaçant le milieu de différenciation trois fois par semaine. Sur Laminin-521, les cellules souches pluripotentes humaines libres de haute qualité indifférenciées forment d’abord des colonies distinctes avec des bords tranchants, qui se fondent à des monocouches homogènes au confluent. La culture dans le milieu basal d’induction, complétée avec cinq blebbistatin micromolar pendant 24 heures produit typiquement une suspension des corps embryoïdes serrés et réguliers de différentes tailles, alors que la morphologie embryoïde de corps ne devrait pas changer de façon spectaculaire pendant l’induction ectodermale de surface dans la suspension, la excroissance coloniale est vue pour apparaître peu de temps après que les corps embryoïdes soient plaqués sur le type quatre de collagène et la matrice de combinaison laminin-521 dans le milieu de différenciation.
Dans les 21 à 25 jours suivant la différenciation, les cellules forment des couches homogènes confluentes, avec morphologie polygonale, typique des cellules épithéliales. Les cellules peuvent ensuite être cryo stockées pour une utilisation ultérieure, car la viabilité et la morphologie sont bien conservées après la décongélation. Au jour 24 de la différenciation, la grande majorité des cellules ont exprimé la protéine appariée de boîte, PAX6, le régulateur principal du développement d’oeil, aussi bien que l’alpha de p63, le marqueur largement reconnu de LESC.
Delta Np63 est coexprimé dans la plupart des cellules alpha positives p63, confirmant le phénotype cellulaire alpha positif alpha np63 le plus spécifique à la cornée. D’autres marqueurs sont exprimés en partie, tandis que d’autres sont indétectables à ce stade, indiquant que la différenciation a progressé vers les progéniteurs épithéliales limbaux unipotents, mais la différenciation terminale en cellules épithéliales cornéelles matures n’a pas encore eu lieu. En moyenne, chaque chargeur indifférencié exempt de cellules souches pluripotentes humaines génère 0,7 cellules au jour 25.
Au moins 65% delta Np63 alpha population de cellules positives peuvent être attendus au jour 24. La cryopréservation purifie davantage la population cellulaire. Dans l’ensemble, les méthodes présentées ici sont relativement simples, mais il y a quelques points critiques à réussir.
La haute qualité du matériau de départ est essentielle, ainsi que les techniques douces et fluides de culture cellulaire en général. Ce protocole fournit des moyens robustes de produire des cellules souches épithéliales limbales pour des applications cliniques, ainsi qu’à diverses fins de recherche. En outre, la méthode peut être facilement modifiée pour la différenciation des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes.
