Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie du système, telles que le mécanisme de régulation derrière le réseau mitotique et les propriétés dynamiques et les fonctions de l’horloge cycle cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle générera une grande quantité de gouttelettes avec plusieurs cycles cellulaires dans chacun d’eux, nous fournissant un cadre à haut débit pour la manipulation quantitative et l’analyse. Pour commencer, jetez des lots d’œufs qui ont des limites peu claires entre les pôles animaux et végétaux ou des taches blanches irrégulières sur le dessus des pôles animaux.
Ensuite, sélectionnez un lot approprié d’œufs d’une grenouille femelle et transférez les œufs dans un bécher de 600 millilitres. Verser un excès de tampon 0,2 x RRO, et ajouter doucement la cystéine dans 1x tampon extrait pour les œufs. Après cela, secouez vigoureusement le bécher à la main pour enlever les couches de gelée des œufs.
Répétez ce lavage trois fois avec un total de 800 millilitres de tampon de cystéine ou jusqu’à ce que les œufs s’agrègent et s’installent au fond du bécher. Après l’enlever la couche de gelée, laver les œufs quatre fois dans un litre de solution 0,2 x RRO. Utilisez une pipette en verre pour ramasser et jeter les œufs qui deviennent blancs.
Versez le tampon RRO hors du bécher et ajoutez 200 millilitres de solution d’ionophore de calcium dans les œufs. Utilisez une pipette en verre pour remuer doucement les œufs jusqu’à ce qu’ils soient activés, et retirez la solution d’ionophore de calcium. Laisser les oeufs dans la solution d’ionophore de calcium pendant trop longtemps initiera l’apoptose.
Nous remuer les œufs pendant 1,5 minutes et vérifier l’efficacité de l’activation. S’ils ne sont pas activés, reprendre en remuant, et vérifier plus fréquemment jusqu’à ce que 90% d’activation est atteint. Une fois que les œufs se déposent au fond du bécher, vérifiez l’efficacité de l’activation.
Les œufs bien activés ont environ 25% du pôle animal et 75% du pôle végétal. Ensuite, lavez les œufs deux fois avec un volume total de 50 millilitres de tampon d’extrait complété par des inhibiteurs de la protéase. Ensuite, transférez soigneusement les œufs sur un microtube snap-cap de 0,4 millilitre.
Centrifuger le microtube pendant 60 secondes à 200 g, puis à 600 g pendant 30 secondes pour emballer les œufs. Ensuite, utilisez une pipette pasteur en verre pour enlever l’excès de tampon sur les œufs après chaque étape. Après ça, écraser les oeufs à 15 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Utilisez une lame de rasoir pour couper les tubes pour séparer les trois couches d’œufs écrasés et garder le cytoplasme brut dans la couche moyenne. Ensuite, transférez le cytoplasme brut pour nettoyer les tubes d’ultracentrifugeuse. Compléter le cytoplasme avec des inhibiteurs de la protéase et de la cytochalasine B à 10 microgrammes par millilitre chacun.
Centrifugeuse le cytoplasme brut à 15 000 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour couper le tube et garder le cytoplasme dans la couche moyenne. Déposer les extraits fraîchement préparés sur la glace.
Tout d’abord, ajouter l’ARNm securin-mCherry aux extraits préparés. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de fluorosurfactant FPPE-PEG à 2 % au mélange extrait d’ARNm. Utilisez un mélangeur vortex pour générer des gouttelettes, en ajustant la vitesse et la durée du vortex au besoin.
Ensuite, inspectez visuellement les gouttelettes pour vous assurer qu’elles sont de taille uniforme. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, transférer les gouttelettes flottant sur le dessus et un volume égal de surfactant dans un tube PCR. Tremper un tube de verre dans la couche de gouttelettes et attendre que les gouttelettes remplissent environ 75 % du tube.
Ensuite, poussez le tube dans la couche de surfactant, et remplissez le tube complètement. Ensuite, remplissez un plat à fond de verre d’huile minérale. Ensuite, utilisez de fines pinces à épiler pour plonger le tube rempli de gouttelettes dans l’huile.
Utilisez une pipette en verre pour enlever les débris visibles ou les gouttelettes qui fuient. Pour éviter le mouvement et les fuites de gouttelettes, le tube de verre rempli de gouttelettes doit être immergé sous l’huile minérale avec soin. Nous pouvons soit pousser le tube sur les deux extrémités avec l’équilibre ou ajouter quelques gouttes d’huile minérale sur les extrémités du tube simultanément en premier.
Après cela, utilisez un microscope à épifluorescence équipé d’un stade xy motorisé pour imager les gouttelettes. Enregistrez des vidéos en accéléré dans le champ lumineux et de multiples canaux de fluorescence toutes les six à neuf minutes jusqu’à ce que les gouttelettes perdent leur activité. En utilisant ce protocole, l’oscillation mitotic dans les cellules simples et nucléaires-libres et les cellules compliquées avec des noyaux ont été produites.
Les gouttelettes sans noyaux ont généré une oscillation mitotique jusqu’à 30 cycles non amortis en 92 heures. La capacité de l’oscillateur mitotic de conduire des événements mitotiques en aval a également été examinée. L’oscillateur mitotique auto-soutenu a conduit les changements de morphologie nucléaire observés par l’altération autonome des phases distinctes de cycle cellulaire.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler à l’esprit le moment où faire l’extrait, car il est sensible au temps, et toujours garder les oeufs et l’extrait sur la glace. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie du système pour explorer les principes fondamentaux des propriétés complexes de l’horloge, comme la tunabilité et la stochasticité à Xenopus laevis.
