Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en embryologie, thérapie génique et transplantation de cellules souches. Un avantage de cette technique est qu’elle permet l’analyse des effets de différentes thérapies expérimentales sur les fœtus murins. Les médecins Nicholas Ahn et Barbara Coons, médecins et chercheurs de notre laboratoire, démontreront cette procédure.
Avant de commencer l’intervention, laissez tomber de cinq à dix microlitres de PBS stérile dans et hors de la pointe de l’aiguille chirurgicale, deux à trois fois pour l’effacer de tout débris possible. Ensuite, remplissez l’aiguille avec le reagent d’intérêt au volume expérimental approprié et la concentration. Et appuyez trois fois sur le bouton mode sur le micro-injecteur pour passer à l’écran d’étalonnage d’injection.
Ajoutez des intervalles de 10 ou 100 millisecondes pour ajuster le temps d’injection et appuyez deux fois de plus sur le bouton mode. Appuyez sur le bouton d’équilibre et appuyez sur la pédale une fois. Appuyez ensuite à nouveau sur la pédale et évaluez le volume de solution qui est vidé de l’aiguille par poussée.
Lorsque le micro-injecteur est calibré au volume expérimental approprié, remplissez l’aiguille au bon niveau pour l’injection. Lorsque toutes les aiguilles ont été nettoyées, confirmer un manque de réponse à la pincée d’ateil de la souris femelle enceinte de deux à six mois. Raser l’abdomen, en prenant soin de ne pas endommager les mamelons, et transférer l’animal à un coussin chauffant en position supine.
Appliquez de la pommade sur les yeux de l’animal et fixez les membres sur le coussin chauffant avec du ruban adhésif. Et désinfecter la peau exposée. Injectez ensuite des anesthésiques locaux tels que 100 microlitres de 0,25%Bupivacaine sous-cutanée.
Ensuite, faire une incision cutanée d’un à deux centimètres de telle sorte que la bordure inférieure n’est pas plus proche d’un centimètre de l’introitus, et d’identifier la ligne médiane du fascia, en prenant soin de ne pas blesser les vaisseaux épigastriques environnants. À l’aide de forceps Adson, pincez le fascia sans saisir aucun des organes sous-jacents ou des fœtus, et ouvrez le tissu avec des ciseaux. Une fois en toute sécurité dans la cavité abdominale, étendre l’incision fasciale à la longueur de l’incision cutanée, et utiliser des applicateurs pointe de coton pour déplacer les intestins dans la partie supérieure de l’abdomen pour exposer l’utérus gravide.
Extraire l’utérus par l’incision en identifiant soigneusement les ovaires droit et gauche pour s’assurer que tous les fœtus sont comptés. Remettre l’utérus gauche dans l’abdomen afin que seul l’utérus droit soit exposé, afin de garder les fœtus non injectés au chaud. Et saisissez doucement au sac amniotique le plus latéral entre le pouce et les index de la main non dominante.
Placez le microscope de dissection au-dessus de l’animal et ajustez la mise au point et l’éclairage pour une meilleure visualisation du foetus si nécessaire. Pour une injection intraveineuse faire pivoter l’utérus de sorte que la vitelline vaine, à injecter est parallèle à la pointe de l’aiguille. Et poser l’aiguille sur l’utérus à un angle de cinq degrés pour percer la paroi utérine.
Avec la pointe entre la paroi utérine et le sac amniotique, placez la pointe directement au sommet de la vitelline vaine et à un angle presque tangentiel, glissez l’aiguille sur le vain jusqu’à ce que le biseau avance dans le navire. Il est impératif que l’angle reste bas afin que l’aiguille ne pénètre pas dans la paroi arrière du navire. Lorsqu’une tache de sang est observée à l’extrémité de l’aiguille, appuyer sur la pédale pour injecter tout le volume du matériau d’intérêt dans le récipient.
Pour une injection intra-amniotique, faites pivoter le sac amniotique jusqu’à ce qu’un endroit dépourvu de vaisseaux soit trouvé. Pointez l’aiguille perpendiculairement à la paroi utérine et percez l’aiguille à travers le sac de jaune d’utérus, et sac amniotique en prenant soin de ne pénétrer aucun tissu fœtal. Injectez ensuite le volume approprié de matériel désiré.
Après l’un ou l’autre type d’injection, retirez l’aiguille du site d’injection une fois que le volume désiré est livré. Et procéder au fœtus suivant jusqu’à ce que tous les fœtus de la corne utérine droite ont été injectés. Puis retourner la corne utérine droite dans l’abdomen.
Et retirez la corne utérine gauche de l’abdomen. Lorsque tous les fœtus de la corne gauche ont été injectés retourner l’utérus entier à l’abdomen, en prenant soin d’éviter un volvulus utérin ou intestinal. Utilisez une pipette de transfert jetable pour distribuer environ deux millilitres de PBS stérile dans l’abdomen, pour remplacer les pertes insensibles.
Et utilisez 4-0 sutures de polyglactine 910 pour fermer le fascia et l’abdomen en une seule couche continue. Ensuite, transférez la souris dans une cage propre sous une lampe thermique avec surveillance jusqu’à ce que la pleine couchée. Dans cette expérience de formation, les foies des fœtus qui ont reçu une transplantation in utero par un stagiaire ont affiché des niveaux fluorescents inférieurs 24 heures après l’injection, en raison d’un engraftment inférieur des cellules GFP transplantées, que les foies injectés par un instructeur expérimenté.
L’analyse cytométrique de flux pour les cellules positives de donneur de GFP a également corrélé avec le niveau inférieur des fluorescents observés sous la microscopie fluorescente. La capacité des vecteurs viraux livrés par voie intra-amniotique à transduire les cellules en contact avec le liquide amniotique. Est illustré par la transduction de cellules épithéliales 48 heures après l’injection in utero du virus Adeno portant le transgène GFP dans le jour gestationnel 12,5 fœtus.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en 15-25 minutes par souris enceinte. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fournir en toute sécurité et efficacement différentes thérapies aux fœtus de souris.
