Notre approche combinée aide à répondre à la façon dont les paramètres de neuroplasticité ultrastructurale changent après les interventions développementales précoces au système nerveux naissant in utero. Le principal avantage de notre méthode est l’acquisition d’images haute résolution de macro-méso-micro-et nanostructures dans le système de coordonnées prédéfini dans un atlas tissulaire. L’implication de notre méthode est son potentiel thérapeutique translationnel pour les maladies neurodégénératives congénitales.
Par exemple, le traitement et le sauvetage à des stades embryonnaires en utilisant cette technique de transduction in utero. Notre méthode peut être appliquée à n’importe quel autre modèle. Par exemple, les espèces de souris peuvent être modifiées, ainsi que le domaine d’intérêt.
Les chercheurs qui essaient notre méthode pour la première fois ont besoin d’une formation chirurgicale approfondie, ainsi que la connaissance de la façon de préparer le tissu à l’imagerie microscopique électronique. Commencez par charger une pointe capillaire personnalisée contenant quatre fois 10 à 11 particules virales du revêtement de type 1 du virus associé à l’adénoo pour la cible désirée, et étiquetée avec du colorant Fast Green sur un tube d’aspirateur. Ajouter 15 microlitres des particules virales associées à l’adénose dans le capillaire.
Ensuite, confirmez un manque de réponse au pincement des pieds chez une souris enceinte anesthésiée de jour embryonnaire 14,5, et désinfectez la peau. Utilisez des forceps d’iris courbés et des ciseaux carburés de tungstène droit pour faire une incision cutanée le long de la linea mediana. À l’aide de pinces Dumont droites pour saisir la paroi péritonéale, continuer le long du linea alba avec des ciseaux Vannas droits et placer un morceau de film de paraffine fenestrated sur l’ouverture abdominale et utiliser un dispositif de cuillère pour exposer les cornes utérine sans endommager les embryons à l’intérieur des cornes.
Après avoir appliqué quelques gouttes de PBS de 37 degrés Celsius sur les cornes utérine, inspectez les embryons pour décevoir les dommages ou les malformations à l’intérieur du sac utérin. Tournez soigneusement les embryons à l’intérieur de leurs sacs jusqu’à ce que la position désirée pour chaque injection soit atteinte. Lorsque les embryons sont en place, injectez un à deux microlitres de la solution de particules virales étiquetée Fast Green dans chaque embryon.
Après que tous les embryons ont été injectés, placez les cornes utériines de nouveau dans la cavité abdominale, et ajoutez quelques gouttes de PBS de 37 degrés Celsius dans l’abdomen. Utilisez ensuite des sutures de taille polyamide 6-0 pour fermer la paroi péritonéale et les sutures de taille polyamide 3-0 et les forceps hémostatiques mosquito de Halsted pour fermer la peau. Pour intégrer des tissus isolés d’intérêt pour la télé-macro photographie, placez l’échantillon de tissu dans un cadre spécial avec l’angle de section reproductible, et documentez les coordonnées.
Remplissez le cadre avec 30 degrés Celsius 3%agarose jusqu’à ce que le tissu est couvert, et couvrir le cadre avec un couvercle en plastique jusqu’à ce que l’agarose a durci. Pendant que l’agarose durcit, utilisez le dispositif graphique télé-macro pour imager le tissu intégré et ses coordonnées dans le cadre. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, transférez le tissu intégré à l’agarose dans le cadre avec des lacunes de coupe correspondant aux coordonnées du premier cadre.
Utilisez un dispositif avec une lame de rasoir mince et vibrante pour couper le tissu incorporé en sections d’une épaisseur expérimentale appropriée. Puis l’image de chaque section de tissu dans PBS, et de recueillir les images dans un dossier. Pour préparer les échantillons de tissus à la microscopie électronique de transmission, dans une armoire de biosécurité, lavez les sections tissulaires avec deux lavages de 30 minutes en PBS, suivis d’une incubation de deux heures dans la solution tétroxide osmium 2% aqueuse à température ambiante.
À la fin de l’incubation, lavez les sections osmicées deux fois de plus dans pbs pendant 30 minutes par lavage et déshydratez les sections en immersion séquentielle d’éthanol de 10 à 15 minutes comme indiqué. Après l’immersion de 70 % d’éthanol, placez chaque échantillon dans un plat noir sur un fond noir terne et imagez les spécimens dans 70 % d’éthanol sous la lumière LED RGB appliquée sur les échantillons des côtés gauche et droit à des angles de 45 degrés. Créez un atlas des images de la section avec des coordonnées en recueillant des images des échantillons en série dans un dossier.
Traitez les spécimens avec deux incubations 100 % éthanol de 30 minutes, suivies de deux incubations d’oxyde de propylène à 30 minutes à 100 %, toutes deux à température ambiante. Pendant que les échantillons couvent, mélanger la résine fraîchement préparée avec l’oxyde de propylène à un contre un et un à deux rapports, et ajouter 3% d’accélérateur aux deux solutions. Après la deuxième incubation d’oxyde de propylène, transférer les échantillons dans la solution moyenne d’intégration d’oxyde de propylène résine un à deux pendant deux heures à température ambiante, suivie d’une incubation de deux heures dans la solution moyenne d’oxyde de propylène résineux en une à la température ambiante.
À la fin de la deuxième incubation, transférer les tissus dans des plats plats en polypropylène, et guérir les tissus incorporés avec de la résine fraîche contenant 3% accélérateur pendant 12 à 24 heures à 65 à 85 degrés Celsius. Ensuite, refroidir le tissu à température ambiante, et enlever les spécimens en résine incorporés de la vaisselle en polypropylène. Pour cartographier une zone d’intérêt, sélectionnez une image contenant la zone d’intérêt de l’atlas d’images précédemment préparé.
Esquissez les bordures de la zone d’intérêt sur l’image sectionnée, superposez optiquement ces bordures sur le spécimen incorporé au microscope et utilisez une aiguille de calibre 26 d’un pouce pour rayer ces bordures de région sur le spécimen de résine. Ensuite, chauffer les spécimens à 95 degrés Celsius afin d’adoucir la résine. Ensuite, sortez les spécimens de résine chaude du four, et utilisez une lame de rasoir pour exciser les zones d’intérêt.
Collez les spécimens sur des barres de fixation en verre acrylique du calibre approprié et coupez les spécimens montés pour les sections semi-minces et ultra-minces. Utilisez un ultramicrotome pour acquérir des sections semi-minces de 0,7 micromètre et ultra-minces de 70 nanomètres, en recueillant les sections semi-minces sur les supports en verre, et les sections ultra-minces sur les grilles de nickel. Tacher les sections semi-minces avec 1% de bleu toluidine en PBS pendant quatre minutes, suivies de plusieurs lavages dans de l’eau déionisée, avant d’examiner les sections par microscopie légère.
Les sections ultra-minces peuvent ensuite être directement évaluées par microscopie électronique de transmission à 180 kilovolts sans autre modification. Après la section, les tranches de tissu sont photographiées par la photographie télé-macro comme vient de le démontrer. Après osmication et immersion à l’éthanol, les sections sont à nouveau photographiées par télé macrographie lumineuse d’interférence, révélant un motif spécifiquement coloré pour chaque surface tissulaire.
Après une déshydratation supplémentaire et une intégration de résine, les zones d’intérêt sont sélectionnées et traitées pour la microscopie électronique de transmission. Dans l’hippocampe et le cervelet, les synapses en fibre moussée sont connues pour présenter des caractéristiques ultrastructurales uniques par rapport à d’autres synapses, y compris les grands boutons présynaptiques. Dans leurs profils transcoupés, les boutons contiennent un grand nombre de vésicules et de mitochondries, et enferment très souvent plusieurs épines dendritiques.
Dans la moelle épinière, le funiculus dorsal contient de nombreuses fibres axonales qui sont myélinées par oligodendroglia. Sur les sections transversales, le funiculus dorsal peut être trouvé entre les deux cornes postérieures de la moelle épinière. Sur les images de microscopie électronique de transmission, des axones myélinés sectionnés transcoupés apparaissent ronds, et les gaines de myéline entourant les axones sont organisées dans les lamellae.
L’atlas préparé et les images micrographiques de microscopie électronique de transmission des paramètres ultrastructuraux sont non seulement utiles pour la comparaison de la neuroplasticité morphologique de différentes sections dans diverses conditions de traitement, mais aussi pour des comparaisons entre les paramètres dans la même zone. N’oubliez pas de bien planifier et préparer avant de commencer la transduction in utero, et d’être sûr d’avoir la sauvegarde des matériaux et des instruments en cas de complications. Suivant notre méthode, d’autres techniques peuvent être ajoutées telles que l’étiquetage immunogold avant la microscopie électronique pour le traçage ultrastructural d’une molécule d’intérêt définie.
En commençant par une vision holistique de l’organisme tout entier et en zoomant vers la topographie moléculaire, nous sommes en mesure d’étudier et de manipuler la relation entre la fonction tissulaire et la morphologie. Le tétoxyde d’osmium est dangereux. Assurez-vous de toujours travailler sous le capot, et de porter des lunettes de protection et des gants à main lorsque vous travaillez avec ce reagent.
