L’objectif global de cette procédure est de générer une démyélinisation généralisée du cortex des deux hémisphères cérébraux dans un modèle de rat en utilisant l’immunisation subclinique contre la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline, suivie d’une injection cérébrale intéressante de cytokines à travers un cathéter implanté. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les maladies inflammatoires démyéliniques du cerveau, telles que la sclérose en plaques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut générer une démyélinisation de la matière grise induite par l’inflammation dans le cortex des deux hémisphères cérébraux sans conduire à des bouchons de substance blanche.
Les implications de cette technique s’étendent vers une meilleure compréhension des mécanismes de la démyélinisation corticale qui est observée principalement dans les types progressifs de sclérose en plaques. Pour commencer cette procédure, assemblez le cathéter et le capuchon du cathéter avec l’entrée. Ensuite, coupez le cathéter à une longueur de deux millimètres avec un scalpel.
Rasez ensuite la tête d’un rat anesthésisé entre les oreilles à l’aide du rasoir électrique. Placez le rat dans le cadre stéréotaxique et fixez sa tête à l’aide des barres d’oreille et de la plaque de morsure. Assurez-vous que la tête est horizontale et vérifiez sa stabilité en appliquant une pression sur elle avec le doigt ou la pince.
Ensuite, appliquez des gouttes oculaires lubrifiantes pour prévenir la sécheresse de la cornée pendant la chirurgie, couvrez les yeux avec un matériau opaque pour éviter toute exposition chirurgicale à la lumière. Ensuite, nettoyez la zone rasée en alternant l’application de 70% d’éthanol et de 10% de complexe d’iode povidone. Pour implanter le cathéter, faites une incision longitudinale d’environ deux centimètres de long le long de la ligne médiane.
Ensuite, utilisez des pinces de bouledogue pour maintenir la peau sur les côtés. Retirez le sang à l’aide d’un applicateur à pointe de coton. Ensuite, retirez le périoste, nettoyez le tissu avec l’applicateur de pointe en coton, exposez le crâne et laissez-le sécher pendant environ une minute.
Ensuite, identifiez les repères anatomiques, lambda, bregma et suture médiale. Avec la perceuse installée sur le cadre stéréotaxique, positionnez la pointe du foret au bregma comme point de départ. Déplacez deux millimètres postérieurs de la bregma et 2,4 millimètres latéralement vers la suture médiale.
Ensuite, percez un trou de 0,5 millimètre de diamètre pour le cathéter à cette position. Percez trois autres trous de 1,3 millimètre de diamètre pour les vis d’ancrage à quelques millimètres du premier trou. Enlevez la poussière osseuse par irrigation avec environ un à deux millilitres de PBS stérile et nettoyez le crâne.
Par la suite, serrez les vis d’ancrage de deux à trois tours complets. Insérez un cathéter de deux millimètres de longueur à travers le premier trou perpendiculaire à la surface du crâne. Tout en tenant toujours le cathéter, appliquez un peu de ciment dentaire et laissez-le polymériser avec une brève exposition à la lumière de durcissement dentaire afin de stabiliser le cathéter.
Ensuite, appliquez plus de ciment dentaire autour du cathéter, ancrez les vis et solidifiez le ciment dentaire avec la lumière de durcissement dentaire pendant environ 15 à 30 secondes, confirmez que le ciment est durci. Après l’implantation, fermez la peau avec des sutures résorbables antérieures et postérieures au cathéter. Ensuite, injectez le mélange d’antidote par voie sous-cutanée.
Ensuite, administrer 2,5% d’enrofloxacine par injection sous-cutanée pour un traitement antibiotique prophylactique. Re renvoyer l’animal dans la cage modifiée et le garder sous observation pendant une à trois heures avec une application de lumière infrarouge pour éviter l’hypothermie. Répétez le traitement à l’enrofloxacine et administrez du carprofène à un milligramme par millilitre par voie sous-cutanée pour soulager la douleur par injection le lendemain de la chirurgie.
Pour préparer le mélange d’immunisation, branchez deux seringues en verre à pointe de verrouillage inférieure de 10 millilitres aux bras courts d’un robinet d’arrêt à trois voies et fermez la troisième sortie avec le bras long. Ensuite, pipettez un millilitre d’IFA et 50 microgrammes de rMOG ensemble. Et ajustez le mélange à un volume final de deux millilitres avec du PBS stérile.
Placez le mélange IFA et rMOG dilué dans la seringue ouverte, puis insérez doucement le piston tout en maintenant une pression lâche sur le piston opposé. Émulsionnez l’inoculum en le conduisant d’une seringue à l’autre en poussant les pistons d’avant en arrière jusqu’à ce qu’il soit blanc et visqueux. Ensuite, fixez une seringue de verrouillage inférieure d’un millilitre au bras court ouvert du robinet d’arrêt à trois voies et remplissez-la d’inoculum.
Distribuer tout l’inoculum dans des seringues d’un millilitre et les garder sur la glace jusqu’à l’injection. Par la suite, injecter 200 microlitres du mélange IFA et rMOG par voie sous-cutanée à la base de la queue sous anesthésie isoflurane temporaire à l’aide d’une aiguille de calibre 21. Pour l’injection intracérébrale de cytokines, ajustez la longueur de la canule du connecteur à deux millimètres.
Remplissez une seringue d’un millilitre avec le mélange de cytokines. Ensuite, connectez la seringue à la canule du connecteur. Ensuite, remplissez la canule avec le mélange de cytokines, évitez de créer des bulles.
Ensuite, montez la seringue sur la pompe à seringue programmable et programmez-la pour qu’elle s’injecte à une vitesse de 0,2 microlitre par minute. Démarrez la pompe et maintenez-la en état de fonctionnement afin d’éviter la formation de bulles d’air à l’extrémité de la canule. Ensuite, retirez le capuchon du cathéter avec l’entrée.
Insérez la canule du connecteur dans le cathéter, vissez-le et serrez-le. Laissez ensuite l’injection se poursuivre pendant 10 minutes avant d’arrêter la pompe. Laissez la canule à l’intérieur du cathéter pendant 20 minutes pour permettre au volume injecté de diffuser complètement.
Par la suite, dévissez la canule du connecteur et retirez-la lentement pour éviter un effet de vide. Reconnectez le capuchon du cathéter à l’entrée et vissez-le. Permettre à l’animal de se remettre de l’anesthésie dans une cage.
La démyélinisation corticale pourrait être évaluée à différents moments après une injection de cytokines par immunohochimie pour la PLP. La figure 6A montre l’immunoréactivité PLP intacte au jour 15 chez un animal témoin immunisé moggy qui n’a reçu que du PBS stérile par le biais du cathéter implanté. Le premier jour après l’injection de cytokines, la démyélinisation pouvait déjà être détectée chez les animaux MOG prime.
Bien que, seulement dans le voisinage proche de la zone cathétérisée. L’immunoréactivité PLP reste intacte dans le cortex controlatéral un jour après l’injection de cytokines. Le troisième jour, une augmentation progressive de la perte de réactivité immunologique PLP, qui se propage dans le cortex ipsilatéral, a pu être observée.
La démyélinisation corticale controlatérale pourrait également être détectée au troisième jour, mais elle est plutôt limitée à la zone située sous les vis d’ancrage. Entre le neuvième et le 15e jour, la démyélinisation affecte de grandes parties du cortex des deux hémisphères. La démyélinisation corticale est maintenue jusqu’à 30 jours après l’injection de cytokines dans les deux hémisphères avec seulement une remyélinisation partielle.
La figure 6J montre une quantification de la perte de PLP dans la matière grise corticale après l’injection intracérébrale de cytokines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer la démyélinisation de la matière grise en utilisant l’immunisation subclinique contre les protéines de myéline, suivie d’une injection intracérébrale de cytokines à travers le cathéter implanté. Ce modèle animal pourrait aider les chercheurs dans l’étude des types progressifs de sclérose en plaques, la démyélinisation de la matière grise en couche est une marque entière.
Le cathéter implanté permet plusieurs cycles de démyélinisation ou d’administration intercérébrale de médicaments thérapeutiques potentiels faisant l’objet d’une investigation préclinique sans provoquer de traumatisme induit par injection.
