The authors gratefully acknowledge the use of facilities at the University of New Hampshire including the University Instrumentation Center. This work was supported by the University of New Hampshire, Department of Chemistry.

études sur les animaux invertébrés effectuées ici ne sont pas réglementés aux États-Unis; par conséquent, le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux n&#39;a aucune autorité pour l&#39;examen de ces protocoles. Au lieu de ceux-ci ne relevant de la compétence de la réglementation aux États-Unis, les auteurs, par les présentes affirment que ces études ont été menées avec un effort sincère envers l&#39;utilisation éthique, les soins et le traitement de ces animaux, le nombre de personnes a été réduit au minimum et ces efforts sont conformes à la Déclaration de Bâle et le Conseil international pour l&#39;expérimentation animale (ICLAS) Lignes directrices en matière d&#39;éthique. 1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection <ol><li> Achat calmar décapité D. pealeii du Département des ressources marines au Laboratoire de biologie marine de Woods Hole, MA ou d&#39;un marché du poisson frais. Ne pas utiliser des échantillons qui ont été filetés ou préalablement modifiés afin d&#39;appliquer cette procédure. Plus précisément, la chromiecouche tophore doit encore être intact sur le spécimen. <ol><li> Si les animaux ne sont pas utilisés immédiatement, les entreposer à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. Pour décongeler les spécimens, placez-les dans de l&#39;eau à température ambiante pendant 1 heure avant la dissection. </li></ol></li><li> Utilisation en acier inoxydable droites ciseaux de dissection pointes fines, coupées le long de la face postérieure de l&#39;animal. Commencez à la base du manteau ventral, et se terminera à la région fin. </li><li> Retirez tous les organes internes (estomac, des branchies, des glandes d&#39;encre, les organes reproducteurs, le cœur systémique, et le cœur brachial) en les soulevant avec pince à disséquer et à rompre leur tissu conjonctif à l&#39;aide des ciseaux de dissection. Jeter les organes dans un sac de spécimen. </li><li> Utilisez disséquant T-broches à la broche du manteau (côté fin vers le haut) dans une norme 11-1 / 2 &quot;x 7-1 / 2&quot; x 1-1 / 2 &quot;pan aluminium dissection contenant un tampon de dissection flexible. Immerger le tissu 250 ml d&#39;eau de mer qui a été filtrée à travers un système de filtration sous vide en polystyrène à usage uniquecontenant 0,2 um taille des pores. </li><li> Retirez délicatement la couche de peau épidermique (couleur opaque) avec une pince à disséquer, en gardant la couche de peau de chromatophores contenant intact. Une fois que la couche de l&#39;épiderme est éliminé, le jeter dans un sac à échantillon. </li><li> Disséquer petits (1 cm x 1 cm) sections de la couche de chromatophores avec des pinces et des ciseaux de dissection. Prélever des échantillons dans des tubes de 1,5 ml de micro-centrifugeuse (remplir la moitié de chaque tube vide avec le tissu disséqué). </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;eau de mer filtrée au tissu contenant des tubes. Les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit à 4 ° C. </li></ol> 2. Isolating Chromatophore Pigment Granules <ol><li> La digestion du tissu <ol><li> Préparation de la papaïne / collagénase <ol><li> Peser 30 mg de collagénase et 5 mg de papaïne en utilisant un &quot;x 4&quot; faible teneur en azote 4 peser papier. Transférer ces derniers dans un polypropylène tube de centrifugeuse de 50 ml avec un bouchon à vis. </li><li> Mesurer 10 ml de deionizl&#39;eau ed l&#39;aide d&#39;une pipette graduée. Ajouter directement au flacon contenant de la papaïne / collagénase. Vortex sur le réglage le plus élevé jusqu&#39;à ce que la solution soit limpide. </li></ol></li><li> Retrait de tissus extracellulaires <ol><li> Centrifuger le tissu collecté de l&#39;étape chromatophores 1,7 pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter la couche supérieure de l&#39;eau de mer dans un seau de déchets plastiques. </li><li> Ajouter 500 ul de la solution de papaïne / collagénase dans le tissu en utilisant un volume variable P1000 canal unique micropipette. Vortex chaque échantillon pendant 1-2 min sur le réglage le plus élevé. </li><li> Soniquer les échantillons pendant 5 minutes à une fréquence de 40 kHz à se dissocier des cellules provenant du tissu environnant. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques. </li><li> Centrifuger le tissu collecté chromatophores pendant 5 min à 14 000 x g. Jeter la couche supérieure de l&#39;eau de mer dans un seau de déchets plastiques. Répéter encore une fois. </li><li> Supprimez manuellement tout en restant un grand sec de tissutions qui ne digèrent dans ce processus avec une pince avant de passer à l&#39;étape suivante. </li></ol></li></ol></li><li> Isoler le Pigment Granules <ol><li> Préparation de Homogénéisation Buffer <ol><li> Peser 2,38 g de (4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES, 100 mM), 0,095 g de chlorure de magnésium (10 mM), 0,856 g de potassium-aspartate (50 mM) et 0,015 g de dithiothréitol (1 mM). Transférer dans un récipient en polystyrène de 150 ml avec un bouchon à vis. Ajouter une mini-comprimé inhibiteur de protéase commerciale. </li><li> Mesurer 100 ml d&#39;eau déminéralisée à l&#39;aide d&#39;une éprouvette graduée. Ajouter directement dans le récipient contenant les sels d&#39;homogénéisation. Vortex jusqu&#39;à ce que la solution est claire. </li></ol></li><li> Homogénéisation de Granules pigmentaires <ol><li> Centrifuger chaque échantillon de l&#39;étape 2.1 à 14000 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques. Cet échantillon doit être vide de tissu extracellulaire. </li><li> Ajouter 500 &amp;# 181; l de tampon d&#39;homogénéisation dans chaque tube et vortexer pendant 1 à 2 min chacun pour bien mélanger les échantillons. Soniquer les échantillons pendant 30 min (~ 40 kHz) et de suivre avec 5 min de centrifugation à 14000 x g. </li><li> Jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques, et répétez l&#39;étape précédente 2-3 fois afin d&#39;assurer la digestion complète des chromatophores sacculus et de protéines longes. La solution restante doit contenir un surnageant jaune clair et une pastille de couleur rouge contenant les granules pigmentaires isolés. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Pigment Extraction <ol><li> Préparation du méthanol acide (HCl-MeOH) <ol><li> ajouter avec précaution 25 pi de concentré (36,5 à 38% (p / p)) de l&#39;acide chlorhydrique (HCl) à 5 ml de methanol (MeOH). Conserver la solution HCl-MeOH dans un bouchon à vis échantillon de verre du flacon. Agiter doucement pour mélanger uniformément la solution. NOTE: Plus la solution est acide, plus pigment sera extrait au cours de la fiextraction première. </li></ol></li><li> Extraction du pigment <ol><li> Centrifuger la suspension de pigment de granule (de 2.2.2) pendant 5 min à 14000 xg et jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques. </li><li> Ajouter 500 ul de la solution de HCl-MeOH et Vortexer chaque échantillon pendant environ 3-4 min. Soniquer les échantillons pendant 10 min (~ 40 kHz), puis centrifuger pendant 5 min à 14 000 x g. </li><li> En utilisant une pipette de transfert, de recueillir le surnageant dans un flacon 1 dram vis-top en verre. Le surnageant doit être de couleur rouge foncé. </li><li> Répétez la 3.2.2 étape d&#39;extraction jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun autre couleur est extrait (~ 4-5 lavages). NOTE: Chaque extraction donnera ~ 1,5 ml de pigment. Le culot incolore restant est le pigment extrait des granules. REMARQUE: Les deux granules incolores et des pigments extraits peuvent être stockés dans l&#39;eau à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li></ol> 4. Caractérisation tout au long du processus d&#39;extraction <ol><li> Numérisation ElECTRON Microscopie <ol><li> Les granules d&#39;image (pas réagi provenant de l&#39;étape 2.2.1 et un pigment extrait à l&#39;étape 3.2.3), en utilisant la microscopie électronique à balayage (SEM) pour vérifier la pureté du procédé d&#39;extraction. </li><li> Pour préparer des échantillons de granulés pour l&#39;imagerie, première centrifugeuse à la fois des granules pigmentaires ayant pas réagi et extrait des granules pendant 5 min à 14000 xg, et jeter le surnageant dans un seau de déchets plastiques. Resuspendre ceux-ci dans 1 ml d&#39;éthanol et de dépôt 2-3 gouttes de la suspension de granulés ONTO moignons aluminium SEM en utilisant une pipette de transfert. </li><li> Après séchage, les échantillons pendant une nuit, par pulvérisation cathodique couche de revêtement d&#39;or-platine pendant 3 min pour obtenir un revêtement de 15 nm. </li><li> L&#39;image en utilisant un MEB avec un émetteur Schottky, et un détecteur d&#39;électrons secondaires. Utilisez une tension de faisceau 5-7 kV et une distance de travail entre 8 et 9 mm à l&#39;image de ces matériaux. </li></ol></li><li> Ultraviolet-visible Mesures spectrophotométriques (UV-vis) <ol><li> Surveiller la pro absorbanceles fichiers pour les 3 conditions (2.2.2 granule n&#39;a pas réagi, du pigment extrait de 3.2.3, et de pigment extrait granules à partir 3.2.4) à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre à double faisceau 200-800 nm. </li><li> Recueillir une mesure à blanc avec de l&#39;eau déminéralisée dans une cuvette de 1 ml pour les granules ayant pas réagi et les pigments extraits granulés. Recueillir des spectres d&#39;absorption UV-Vis pour les deux échantillons. </li><li> Recueillir une mesure à blanc en utilisant la solution de méthanol acide dans une cuvette de 1 ml pour le pigment extrait. Recueillir le spectre d&#39;absorption UV-Vis pour l&#39;échantillon. </li><li> Déterminer la longueur d&#39;onde maximale de chaque échantillon en identifiant la longueur d&#39;onde à laquelle le pic d&#39;absorbance atteint sa hauteur maximale relative. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin.">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li><li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflectins:+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues.">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li><li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores.">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li><li>M&#228;thger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods.">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li><li>M&#228;thger, L. M., Hanlon, R. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid,+Loligo+opalescens,+to+nerve+stimulation+and+drugs.">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li><li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores.">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+(Lepidoptera:+Nymphalidae).">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li><li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis.">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li><li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System.">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118, (2016).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Nous avons démontré une méthode pour extraire les pigments de granulés de chromatophores calmar. En ciblant spécifiquement les granules, notre objectif est de déterminer leur rôle dans la médiation de la coloration adaptative. Cette méthode diffère des précédents rapports conçus pour caractériser les pigments de céphalopodes en utilisant des échantillons de tissus en vrac 14 ou lyophilisé la peau 15. Bien que ce protocole est efficace pour l&#39;extraction des pigments de chromatophores, elle est limitée à de petites échelles de réaction. Disséquer un rendement calmar ~ 11 mg de granules purifiés. Environ 58% de cette masse contient le pigment soluble, qui est extrait en utilisant la solution de HCl-MeOH 12. La pureté du tissu à partir chromatophores influe directement sur le rendement en produit à partir d&#39; une dissection. Si les échantillons semblent contaminés par un excès de tissu épidermique ou iridophore recueillies lors de la dissection, il est préférable de séparer le contenu de l&#39;échantillon, les remettre en suspension dans buf supplémentairesfer, et commencer l&#39;homogénéisation étapes encore. Isoler une population pure de granules pigmentaires de tissu chromatophores peut prendre jusqu&#39;à huit, 4 cycles hr sonication qui pourrait étendre sur 4 jours. Il est important de rester dans l&#39;isolement du patient afin d&#39;assurer une population pure de granulés de pigment. La pureté de la solution de départ des granules influe également sur le pigment étapes d&#39;extraction avec du HCl-MeOH. Si les granulés sont obstrués par du tissu non digérés, il suffit de vortex et sonication les échantillons jusqu&#39;à 1 h et homogénéiser l&#39;échantillon avant de recommencer l&#39;extraction. Souvent 4-5 lavages à l&#39;aide de 500 pi de HCl-MeOH par échantillon sont nécessaires pour extraire le pigment à partir des granulés. Si fait correctement, cette procédure donnera entre 2-3 ml de pigment soluble par échantillon. Quand on utilise une purification supplémentaire par Chromatographie sur couche mince, les pigments isolés séparés en quatre fractions uniques contenant des concentrations variables de xanthommatine et decarboxanthommatine xylated. 12 Cette méthode peut être utilisée par les chimistes, des biologistes, ou les ingénieurs à mieux comprendre le rôle des pigments dans la modulation de la couleur. La présence du pigment dans les granules suggère un mécanisme hiérarchique pour la coloration dans les céphalopodes qui provient des composants moléculaires contenus dans nanostructuré chromatophores des granulés de pigments. Ces résultats peuvent être utilisés pour informer les systèmes d&#39;ingénierie conçus pour imiter la gamme dynamique de la couleur adaptative affichée dans les céphalopodes utilisant des nanoparticules pigmentées préemballés.

Céphalopodes tels que les calmars, seiches, poulpes et ont la capacité de modifier dynamiquement leur apparence pour le camouflage et la signalisation. 1-6 Cette capacité est prise en charge en partie par l&#39;expansion zonale sélective des organes pigmentées appelées chromatophores. 4,7-9 Chromatophores sont actionneurs souples qui contiennent un réseau de granulés de pigment nanostructurés confinés dans un saccule cytoelastic qui est ancrée radialement par des fibres musculaires. 1,3 Comme ils sont actionnés, étendent des chromatophores de 500% dans la surface présentée à distribuer les granulés à travers l&#39;organe. 3,7- , 10,11 Lorsque cette action est concertée sur un certain nombre de chromatophores, la coloration générale de l&#39;animal est changé. Bien qu&#39;il soit connu que les granulés de pigment contribuent à ce changement de couleur, leur composition reste inconnue. Nous décrivons une procédure pour isoler et purifier des pigments chromatophores qui peuvent être adaptés pour les futures études de composition. 3,12 Chromatophore tissu contenant est récolté par l&#39; extirpation attention du céphalopode. Un procédé de digestion et de l&#39;homogénéisation est ensuite utilisée pour dissocier le tissu environnant et séparer les cellules chromatophores. Les granulés nanostructurés sont ensuite isolés et purifiés à partir des chromatophores restantes en utilisant la sonication et centrifugation répétée. Après purification, les pigments sont extraits des granules dans un processus qui est adapté de l&#39;extraction de couleur visible à partir des ailes de papillon en utilisant des solutions de méthanol acides. Microscopie électronique 13 à balayage (MEB) et spectrophotométrie sont utilisés pour confirmer que les pigments de chromatophores sont extraits avec succès en utilisant ce processus. Cette méthode décrit l&#39;isolement des granulés de chromatophores qui est utilisé pour explorer la contribution moléculaire à coloration dans les céphalopodes. 12 petites extractions de molécules provenant d&#39; animaux entiers peuvent souvent être un processus long et fastidieux. Le but ici est d&#39;informer les futurs chercheurs d&#39;un protocole efficace et facile pour l&#39;acquisition de pigments des granules nanostructurés en céphalopodes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="611">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Collagenase</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">9001-12-1</td>
			<td style="width:205px;">No hazard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3482-12-3</td>
			<td>Irritant, acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>Mild irritant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:71px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">k-Aspartate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1115-63-5</td>
			<td>Reacts violently with oxidants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td>Mild eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Pharmco-AAPER</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td>Highly flammable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mini tablet prtoease inhibitor</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">469315-90-01</td>
			<td>Corrosive to metal and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Papain</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9001-73-4</td>
			<td>Irritant&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for extracting pigments from squid doryteuthis pealeii

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Chromatophores sont disséqués à partir du D. pealeii dorsale manteau (Figure 1A, 1B). Une fois qu&#39;ils sont retirés, les chromatophores sont lysées et purifiées en utilisant des cycles de centrifugation et de lavage pour isoler les granulés pigmentés (figures 2A, 2B). Des solutions de méthanol acide (HCl-MeOH) sont utilisées pour extraire le pigment à partir des granulés (figure 2C), ce qui donne un extrait de pigment soluble et des granules de pigment insolubles, on extrait incolores. Le procédé d&#39;extraction permet de réduire le diamètre moyen des granules. Ceci est observé par microscopie électronique à balayage (MEB). Avant que les granulés sont exposés à du HCl-MeOH, ils ont un diamètre moyen de (527,3 ± 91,8) nm (N = 100, l&#39; erreur est l&#39; écart type, la figure 3A). Lorsque le pigment est extrait à partir des granulés, la diminution de la tailles à (202,6 ± 32,2) nm (N = 100, l&#39; erreur est l&#39; écart type; la figure 3B). Cette réduction de taille est supposée être due à l&#39;extraction du pigment à partir du granulé lorsqu&#39;il est traité avec du HCl-MeOH. Pour tester cette hypothèse, les différences de pré- couleur visible et l&#39;extraction post sont surveillés en utilisant la microscopie lumineuse et spectrophotométrie. Lors de l&#39; addition de HCl-MeOH, la couleur associée à des granulés réduit visiblement pas réagi (figure 4A). Cela se caractérise en outre l&#39; utilisation UV-vis spectrophotométrie (figure 4B), où un large profil d&#39;absorbance (~ 280-800 nm) est observée pour les granules pré-extrait et les granulés de post-extraction, mais à une intensité beaucoup plus faible; tandis que, l&#39;extrait soluble de pigment présente une lambda max centrée à ~ 500 nm avec un épaulement à ~ 380 nm. Collectivement, ces données suggèrent une méthode avec succès pour extraire la couleur visible à partir des granulés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54803/54803fig1.jpg" /> Figure 1: Chromatophores de calmar D. pealeii. (A) Squid D. pealeii manteau dorsal. (B) de l&#39; image lumineuse du champ de chromatophores rouges, jaunes et bruns. Barre d&#39; échelle = 1 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54803/54803fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54803/54803fig2.jpg" /> Figure 2:. Illustration du processus d&#39;extraction (A) Chromatophores sont disséqués. (B) les granulés de pigments sont éliminés à partir de tissus homogénéisés chromatophores et purifiés en utilisant une série de cycles de centrifugation et de lavage. (C) Le pigment peut être ex<html> subdivisées à partir des granulés en utilisant HCl-MeOH donne un surnageant de pigment soluble qui est séparé des granules de pigment incolore extraits. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54803/54803fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54803/54803fig3.jpg" /> Figure 3: HCl-MeOH extraction alters diamètres des granulés nanostructurés micrographies électroniques à balayage (A) de methanol pré-acide extrait des granules de pigment et (B) de post-méthanol acide extrait des granules de pigment.. Barre d&#39; échelle = 1 pm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54803/54803fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> télécharger / 54803 / 54803fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4: HCl-MeOH extraction altère la couleur visible de granulés nanostructurés (A) images de champ lumineux de granules pigmentaires tout au long du processus d&#39;extraction.. (B) de spectres Absorbance de pré (noir) - et post (bleu) -. Extraction avec le surnageant de pigment (rouge) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54803/54803fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Un protocole pour l&#39;extraction de pigments à partir des granulés nanostructurés dans squid Doryteuthis pealeii chromatophores est présenté.

Un procédé d&#39;extraction Pigments de Squid<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

9.3K vues.  University of New Hampshire.  Un protocole pour l'extraction de pigments à partir des granulés nanostructurés dans squid Doryteuthis pealeii chromatophores est présenté. 

Vidéo: A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Extraction d&#39;ADN de l&#39;microbes de l&#39;intestin des termites (Zootermopsis Angusticollis) et Visualisation microbes de l&#39;intestin

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Recherche

Biologie

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

L&#39;utilisation de Rotorod comme une méthode pour l&#39;analyse qualitative de la marche chez le rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Une méthode CLHP lectine pour enrichir sélectivement peptides glycosylés d&#39;échantillons biologiques complexes

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made significant contributions to our understanding of the co-evolution of eukaryotes with their microbiota. The symbiotic association between the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and the bioluminescent bacterium Vibrio fischeri has been utilized as a model system for understanding the effects of beneficial bacteria on animal development. Recent studies have shown that macrophage-like hemocytes, the sole cellular component of the squid host's innate immune system, likely play an important role in mediating the establishment and maintenance of this association. This protocol will demonstrate how to obtain hemocytes from E. scolopes and then use these cells in bacterial binding assays. Adult squid are first anesthetized before hemolymph is collected by syringe from the main cephalic blood vessel. The host hemocytes, contained in the extracted hemolymph, are adhered to chambered glass coverslips and then exposed to green fluorescent protein-labeled symbiotic Vibrio fischeri and non-symbiotic Vibrio harveyi. The hemocytes are counterstained with a fluorescent dye (Cell Tracker Orange, Invitrogen) and then visualized using fluorescent microscopy.

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

This video will demonstrate how to obtain hemocytes (blood cells) from the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes for use in cell biological and bacterial adhesion assays. Hemocytes will be stained with a fluorescent dye and exposed to GFP-labeled bacteria.

Obtention hémocytes de l&#39;Hawaiian Bobtail Squid Scolopes Euprymna Et en observant leur adhésion aux bactéries symbiotiques et non symbiotiques

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Un protocole simple pour extraire l&#39;hémocytes de chenilles sauvages

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Une méthode pratique et roman d&#39;extraire l&#39;ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...