The authors gratefully acknowledge the use of facilities at the University of New Hampshire including the University Instrumentation Center. This work was supported by the University of New Hampshire, Department of Chemistry.

الدراسات على الحيوانات اللافقارية التي أجريت في هذه الوثيقة لا تنظم في الولايات المتحدة؛ لذا يتعين على اللجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي أي سلطة لإعادة النظر في هذه البروتوكولات. بدلا من هذه التي لا تندرج تحت اختصاص التنظيم في الولايات المتحدة، والكتاب نعلن هنا أن أجريت هذه الدراسات مع جهد صادق نحو الاستخدام الأخلاقي، والرعاية، والعلاج من هذه الحيوانات، والتقليل من عدد من الأفراد وهذه الجهود تتفق مع إعلان بازل والمجلس الدولي لمختبر علم الحيوان (ICLAS) المبادئ التوجيهية الأخلاقية. 1. Doryteuthis pealeii (د pealeii) تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء قطع رأس الحبار د. pealeii من وزارة الموارد البحرية في المختبر البيولوجي البحري في وودز هول، MA أو من أي سوق الأسماك الطازجة. لا تستخدم العينات التي تم منزوع أو تغييرها في وقت سابق من أجل تطبيق هذا الإجراء. على وجه التحديد، وصفاءيجب أن يكون لا يزال طبقة tophore سليمة على عينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يتم استخدام الحيوانات فورا، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. محاولة لكسر جمود العينات، ووضعها في الماء درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة قبل تشريح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ على التوالي مقص تشريح غرامة نقطة، وقطع على طول الجانب الخلفي من الحيوان. تبدأ في قاعدة عباءة بطني، وينتهي عند منطقة الزعانف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كافة الأعضاء الداخلية (المعدة، الخيشومية، غدة الحبر، والأعضاء التناسلية والقلب النظامية، والقلب العضدية) التي رفعها مع تشريح ملقط وقطع أنسجتهم الضام باستخدام مقص تشريح. تجاهل أجهزة في كيس العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تشريح T-دبابيس لدبوس عباءة (الجانب زعنفة متابعة) في معيار 11-1 / 2 &quot;س 7-1 / 2&quot; س 1-1 / 2 &quot;الألومنيوم تشريح عموم تحتوي على لوحة تشريح مرنة. يغرق في الأنسجة 250 مل من مياه البحر التي تم تصفيتها من خلال نظام الترشيح فراغ البوليسترين القابل للتصرفتحتوي على 0.2 ميكرومتر أحجام المسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إزالة طبقة البشرة الجلد (لون معتم) مع ملقط تشريح، والحفاظ على صبغية تحتوي على طبقة الجلد سليمة. وبمجرد إزالة طبقة البشرة، تخلص منه في كيس العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح صغيرة (1 سم × 1 سم) أجزاء من طبقة صبغية مع ملقط ومقص تشريح. جمع العينات في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة (ملء نصف واحد من كل أنبوب فارغ مع تشريح الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من مياه البحر التي تمت تصفيتها إلى الأنسجة التي تحتوي على أنابيب. العينات يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. عزل صبغية صبغات حبيبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غراء / كولاجيناز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 30 ملغ من كولاجيناز و 5 ملغ من غراء باستخدام 4 &quot;× 4&quot; النيتروجين انخفاض وزن الورق. نقل هذه إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي البولي بروبيلين مع غطاء المسمار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 10 مل من deionizإد المياه باستخدام ماصة تخرج. مباشرة إضافة إلى قارورة تحتوي على غراء / كولاجيناز. دوامة على أعلى الإعداد حتى حل واضح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة خارج الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الأنسجة صبغية التي تم جمعها من الخطوة 1.7 لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل الطبقة العليا من مياه البحر في دلو النفايات البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من محلول غراء / كولاجيناز إلى الأنسجة باستخدام P1000 حجم متغير قناة واحدة micropipette. دوامة كل عينة لمدة 1-2 دقائق على أعلى الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن العينات لمدة 5 دقائق على تردد 40 كيلوهرتز إلى فصل الخلايا من الأنسجة المحيطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الأنسجة صبغية التي تم جمعها لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل الطبقة العليا من مياه البحر في دلو النفايات البلاستيكية. أكرر مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدويا إزالة أي ثانية الأنسجة كبير المتبقيةستعقد التي لم تهضم في هذه العملية مع ملقط قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل صبغات حبيبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التجانس العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 2.38 غرام من (4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES، 100 مم)، 0.095 غرام من كلوريد المغنيسيوم (10 ملم)، 0.856 غرام من البوتاسيوم اسبارتاتي (50 ملم)، و0.015 غرام من dithiothreitol (1 ملم). نقل إلى وعاء البوليسترين 150 مل مع غطاء المسمار. إضافة واحد تجاري لوحي مصغر مثبط البروتياز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 100 مل من الماء منزوع الأيونات باستخدام الاسطوانة. مباشرة إضافة إلى الحاوية التي تحتوي على أملاح التجانس. دوامة حتى حل واضح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجانس حبيبات الصباغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي كل عينة من الخطوة 2.1 في 14000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية. وينبغي أن تكون هذه العينة باطلة من النسيج خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 &amp;# 181؛ ل العازلة التجانس لكل أنبوب ودوامة لمدة 1-2 دقائق لكل منهما لمزيج دقيق العينات. يصوتن العينات لمدة 30 دقيقة (~ 40 كيلو هرتز) وتابع مع 5 دقائق من الطرد المركزي في 14000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية، وكرر الخطوة السابقة 2-3 مرات لضمان الهضم الكامل للكييس صبغية والبروتين الحبال. وينبغي أن يتضمن الحل المتبقية طاف أصفر فاتح وبيليه أحمر اللون تحتوي على حبيبات الصباغ معزولة. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. صبغات استخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الميثانول حمضي (حمض الهيدروكلوريك-MeOH) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إضافة 25 ميكرولتر من تتركز (36،5 حتي 38٪ (ث / ث)) حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) إلى 5 مل من الميثانول (MeOH). تخزين حل حمض الهيدروكلوريك-MeOH في سقف المسمار عينة زجاج القارورة. دوامة بلطف لمزج موحد الحل. ملاحظة: أكثر حمضية الحل، سيتم استخراج المزيد من الصباغ خلال فاياستخراج RST. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الصباغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق الصباغ الحبيبية (من 2.2.2) لمدة 5 دقائق في 14000 x ج وتجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من محلول حمض الهيدروكلوريك-MeOH ودوامة كل عينة ل~ 3-4 دقيقة. يصوتن العينات لمدة 10 دقيقة (~ 40 كيلو هرتز)، ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نقل، وجمع طاف في 1 درهم قارورة المسمار أعلى الزجاج. وينبغي أن يكون طاف الأحمر الداكن اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر 3.2.2 استخراج الخطوة حتى يتم استخراج أي لون آخر (~ 4-5 يغسل). ملاحظة: كل استخراج تسفر ~ 1.5 مل من الصباغ. بيليه عديم اللون المتبقي هو الصباغ استخراج حبيبات. ملاحظة: كل من حبيبات عديم اللون وأصباغ المستخرج يمكن تخزين في الماء عند 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. </li></ol></li></ol> 4. توصيف طوال عملية استخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح شركةectron المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة حبيبات (غير المتفاعل من الخطوة 2.2.1 ومن الخطوة 3.2.3-استخراج الصباغ) باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) للتحقق من نقاء عملية الاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد العينات الحبيبية للتصوير، أجهزة الطرد المركزي الأول سواء حبيبات غير المتفاعل والصباغ استخراج حبيبات لمدة 5 دقائق في 14000 x ج، وتجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية. اعادة تعليق هذه في 1 مل من الايثانول، وإيداع 2-3 قطرات من تعليق الحبيبية على بذرة الألومنيوم SEM باستخدام ماصة نقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تجفيف العينات بين عشية وضحاها، تفل معطف مع طلاء الذهب والبلاتين لمدة 3 دقائق لتحقيق طلاء 15 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة باستخدام SEM مع باعث شوتكي وكشف الإلكترون الثانوية. استخدام 5-7 كيلو فولت شعاع الجهد والعمل لمسافات ما بين 8 و 9 ملم الى صورة هذه المواد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأشعة فوق البنفسجية مرئية (الأشعة فوق البنفسجية تجاه) القياسات الطيفية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الامتصاصية المواليةملفات لجميع الظروف 3 (الحبيبية غير المتفاعل من 2.2.2، الصباغ المستخرج من 3.2.3، والصباغ استخراج حبيبات من 3.2.4) باستخدام شعاع الطيف الضوئي المزدوج 200-800 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قياس فارغة باستخدام الماء منزوع الأيونات في كوفيت 1 مل لحبيبات غير المتفاعل والصباغ استخراج حبيبات. جمع أشعة فوق البنفسجية فيس أطياف الامتصاص للعينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قياس فارغة باستخدام محلول الميثانول الحمضية في كوفيت 1 مل لالصباغ المستخرج. جمع أشعة فوق البنفسجية فيس طيف الامتصاص للعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الحد الأقصى الطول الموجي من كل عينة عن طريق تحديد الطول الموجي الذي ذروة الامتصاصية يصل أقصى ارتفاع لها النسبي. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin.">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li><li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflectins:+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues.">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li><li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores.">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li><li>M&#228;thger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods.">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li><li>M&#228;thger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid.">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li><li>M&#228;thger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malleable+skin+coloration+in+cephalopods:+selective+reflectance,+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores.">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li><li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatophore+Organs,+Reflector+Cells,+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods.">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li><li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+(Sepia+officinalis+L)-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour.">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li><li>Sutherland, R. L., M&#228;thger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects.">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li><li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores.">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li><li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid,+Loligo+opalescens,+to+nerve+stimulation+and+drugs.">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li><li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores.">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+(Lepidoptera:+Nymphalidae).">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li><li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis.">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li><li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System.">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118, (2016).</li></ol>

We have nothing to disclose.

لقد أثبتت طريقة لاستخراج الصبغات من حبيبات صبغية الحبار. التي تستهدف على وجه التحديد الحبيبات، وهدفنا هو تحديد دورها في التوسط تلوين التكيف. يختلف هذا الأسلوب من التقارير السابقة تهدف إلى تميز أصباغ رأسيات الأرجل باستخدام عينات الأنسجة السائبة 14 أو تجميد المجفف الجلد 15. في حين أن هذا البروتوكول هو فعال في استخراج أصباغ صبغية، فإنه يقتصر على جداول رد فعل الصغيرة. تشريح واحدة عوائد الحبار ~ 11 ملغ من حبيبات تنقيته. ما يقرب من 58٪ من هذه الكتلة تحتوي على صبغة القابلة للذوبان، والتي يتم استخراج باستخدام محلول حمض الهيدروكلوريك-MeOH 12 نقاء الأنسجة صبغية بدءا يؤثر بشكل مباشر على المحصول المنتج من تشريح واحدة. إذا يبدو العينات الملوثة البشرة الزائدة أو الأنسجة iridophore التي تم جمعها خلال تشريح، فمن الأفضل لفصل محتويات العينة، و resuspend لهم في BUF إضافيةفر، والبدء في تجانس الخطوات تكرارا. عزل السكان نقية من حبيبات الصباغ من الأنسجة صبغية قد يستغرق ما يصل إلى ثمانية، 4 دورات ساعة صوتنة التي يمكن أن تمتد عبر 4 أيام. ومن المهم أن يبقى المريض في عزلة لضمان السكان نقية من حبيبات الصباغ. نقاء حل الحبيبية بدءا يؤثر أيضا على خطوات استخراج الصباغ مع حمض الهيدروكلوريك-MeOH. إذا المغطي حبيبات من الأنسجة غير المهضومة، ببساطة دوامة ويصوتن العينات يصل إلى 1 ساعة وتجانس العينة قبل البدء في استخراج مرة أخرى. مطلوب في كثير من الأحيان 4-5 يغسل باستخدام 500 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك-MeOH لكل عينة لاستخراج الصباغ من حبيبات. إذا فعلت بشكل صحيح، وهذا الإجراء تسفر بين 2-3 مل من صبغة للذوبان في العينة. عندما يعمل تنقية إضافية عبر رقيقة اللوني طبقة، أصباغ معزولة منفصلة إلى أربعة أجزاء فريدة من نوعها تحتوي على تركيزات مختلفة من xanthommatin وdecarboxanthommatin xylated 12 ويمكن استخدام هذه الطريقة من قبل الكيميائيين والبيولوجيين والمهندسين أو إلى فهم أفضل لدور أصباغ في تعديل اللون. وجود الصبغة داخل حبيبات يشير إلى وجود آلية التسلسل الهرمي للتلوين في رأسيات الأرجل الذي ينبع مع المكونات الجزيئية الواردة في حبيبات الصباغ ذات البنية النانومترية صبغية. ويمكن استخدام هذه النتائج للإبلاغ عن أنظمة التصميم الهندسي والمصممة لتقليد مجموعة ديناميكية من اللون التكيف عرضها في رأسيات الأرجل استخدام الجسيمات النانوية المصطبغة المعلبة.

<html> رأسيات الأرجل مثل الحبار، الحبار، والأخطبوط لديها القدرة على تغيير مظهرها لتمويه والإشارات بشكل حيوي. 1-6 ويدعم هذه القدرة في جزء من التوسع المساحي الانتقائي للأجهزة الصباغية المعروفة باسم chromatophores. 4،7-9 Chromatophores هي المحركات الغازية التي تحتوي على شبكة من حبيبات الصباغ ذات البنية النانومترية محصورة ضمن كييس cytoelastic أن يرتكز شعاعيا من الألياف العضلية. 1،3 وودفعتها أنها، chromatophores توسع بنسبة 500٪ في مساحة عرضها توزيع الحبيبات في جميع أنحاء الجهاز. 3،7 ، 10،11 عندما يتم منسقة هذا العمل على مدى عدد من chromatophores، يتم تغيير تلوين الشامل للحيوان. في حين أنه من المعروف أن حبيبات الصباغ تساهم في هذا التغيير اللون، لا يزال تكوينها غير معروف. نحن تصف الإجراء لعزل وتنقية أصباغ صبغية التي يمكن تكييفها للدراسات التركيبية في المستقبل. SS = &quot;jove_content&quot;&gt; عزلة حبيبات الصباغ ينطوي على استخراج متعددة الخطوات، التجانس، وإجراء تنقية. تحصد 3،12 صبغية تحتوي على الأنسجة من خلال استئصال حذرا من الرخويات. ثم يتم استخدام عملية الهضم والتجانس لفصل الأنسجة المحيطة بها، وفصل خلايا صبغية. حبيبات ذات البنية النانومترية ثم يتم معزولة وتنقيته من chromatophores المتبقية باستخدام صوتنة المتكررة والطرد المركزي. على تنقية، يتم استخراج الصبغات من حبيبات في العملية التي يتم تكييفها من استخراج اللون مرئية من أجنحة فراشة باستخدام حلول الميثانول الحمضية. وتستخدم 13 الضوئي المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والقياس الطيفي للتأكد من أن الصبغات صبغية يتم استخراج بنجاح باستخدام هذه العملية. يصف هذا الأسلوب عزلة حبيبات صبغية الذي يستخدم لاستكشاف المساهمات الجزيئية لجoloration في رأسيات الأرجل. 12 الاستخراج جزيء صغير من الحيوانات كلها وغالبا ما يكون عملية طويلة وشاقة. والهدف هنا هو إطلاع الباحثين في المستقبل من نظام فعال وسطحي لشراء أصباغ من حبيبات ذات البنية النانومترية في رأسيات الأرجل.

<table><tbody><tr><td>Collagenase</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>No hazard</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>Irritant, acute toxicity</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>Mild irritant</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>EMD Chemicals</td><td>7647-01-0</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>k-Aspartate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>Reacts violently with oxidants</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Mild eye irritant</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>Highly flammable</td></tr><tr><td>Mini tablet prtoease inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>Corrosive to metal and skin</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>Irritant&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a method for extracting pigments from squid doryteuthis pealeii

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

يتم تشريح Chromatophores من د. pealeii ظهري عباءة (الشكل 1A، 1B). مرة واحدة يتم إزالتها، وهي lysed chromatophores وتنقيتها باستخدام الطرد المركزي وغسل دورات لعزل من الحبيبات الصباغية (أرقام 2A، 2B). وتستخدم حلول الميثانول الحمضية (حمض الهيدروكلوريك-MeOH) لاستخراج الصباغ من حبيبات (الشكل 2C)، مما أسفر عن استخراج الصباغ القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان، عديم اللون حبيبات استخراج الصباغ. عملية استخراج يقلل من متوسط ​​قطر الحبيبات. ويلاحظ هذا باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). قبل أن تتعرض حبيبات لحمض الهيدروكلوريك-MeOH، لديهم متوسط قطرها (527.3 ± 91.8) نانومتر (N = 100، الخطأ هو الانحراف المعياري، الشكل 3A). عندما يتم استخراج الصباغ من حبيبات، وانخفاض حجمالصورة إلى (202.6 ± 32.2) نانومتر (N = 100، الخطأ هو الانحراف المعياري، الشكل 3B). ويفترض هذا التخفيض حجم أن ذلك يعود إلى استخراج الصباغ من الحبيبية عندما تعامل مع حمض الهيدروكلوريك-MeOH. لاختبار هذه الفرضية، ويتم رصد الاختلافات في واضحة مسبقا اللون واستخراج ما بعد باستخدام المجهر الضوئي والقياس الطيفي. على إضافة حمض الهيدروكلوريك-MeOH، وهو اللون الذي يرتبط مع حبيبات غير المتفاعل يقلل بشكل واضح الشكل (4A). يتميز هذا أيضا باستخدام الأشعة فوق البنفسجية تجاه الطيفي (الشكل 4B)، حيث لوحظ الشخصي الامتصاصية واسع (~ 280-800 نانومتر) لحبيبات استخراج مسبقا وحبيبات بعد استخراجها، وإن كان أقل كثافة بكثير. في حين، واستخراج الصباغ للذوبان يسلك ماكس امدا تركزت في ~ 500 نانومتر، مع الكتف في ~ 380 نانومتر. بشكل جماعي، وتشير هذه البيانات طريقة لاستخراج بنجاح لون مرئية من حبيبات. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54803/54803fig1.jpg" /> الشكل 1: Chromatophores من الحبار د. pealeii. (A) الحبار د. pealeii ظهري عباءة. (ب) صورة حقل مشرق من chromatophores الأحمر والأصفر، والبني. شريط مقياس = 1 مم. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54803/54803fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54803/54803fig2.jpg" /> الشكل 2: رسم توضيحي لعملية الاستخراج يتم تشريح (A) Chromatophores. تتم إزالة (ب) حبيبات الصباغ من النسيج المتجانس صبغية وتنقيته باستخدام سلسلة من الطرد المركزي وغسل دورات. (ج) الصبغة يمكن أن يكون السابقين<html> مطولة من حبيبات باستخدام حمض الهيدروكلوريك-MeOH مما أسفر عن طاف الصباغ للذوبان والتي يفصلها عن حبيبات الصباغ عديم اللون المستخرج. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54803/54803fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54803/54803fig3.jpg" /> الشكل (3): حمض الهيدروكلوريك-MeOH أقطار استخراج يغير من حبيبات نانوية الميكروسكوب الضوئي الإلكترون (A) الميثانول قبل الحمضية المستخرجة حبيبات الصباغ و (ب) الميثانول بعد الحمضية المستخرجة حبيبات الصباغ. مقياس شريط = 1 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54803/54803fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> تحميل / 54803 / 54803fig4.jpg &quot;/&gt; الشكل 4: حمض الهيدروكلوريك-MeOH استخراج يغير اللون المرئي من حبيبات نانوية (A) مشرق الصور مجال حبيبات الصباغ في جميع مراحل عملية استخراج. (ب) أطياف الامتصاص من قبل (أسود) - وظيفة (الأزرق) - استخراج جنبا إلى جنب مع طاف الصباغ (الأحمر) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54803/54803fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii at JoVE.com

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

ويرد بروتوكول لاستخراج الصبغات من حبيبات ذات البنية النانومترية في Doryteuthis pealeii chromatophores الحبار.

منهج في استخراج أصباغ من الحبار<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

9.3K Views.  University of New Hampshire.  ويرد بروتوكول لاستخراج الصبغات من حبيبات ذات البنية النانومترية في Doryteuthis pealeii chromatophores الحبار. 

Video: A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

مختبر الأحيائي تغذية الأسماك لتقييم آخر Antipredatory من المركبات الثانوية من الأنسجة من الكائنات البحرية

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Environment

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

قياس التصبغ البطن في<em&gt; ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Genetics

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

الماء في مستحلب النفط: نظام جديد لتجميع البروتينات ملزم الكلوروفيل المياه القابلة للذوبان مع أصباغ مسعور

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Chemistry

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

عزل وإدماج هوائيات حصاد الضوء من دياتوم مينيغينيانا سيكلوتيلا في الدهنية مع الدهون ثايلاكويد

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Biochemistry

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

أساليب لفترات الخوادر التدريج والقياس للجناح تصبغ المورفولوجية جوتيفيرا

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from harmful ultraviolet radiations. Perturbations in melanocyte functioning lead to pigmentary disorders such as piebaldism, albinism, vitiligo, melasma, and melanoma. Zebrafish is an excellent model system to understand melanocyte functions. The presence of conspicuous pigmented melanocytes, ease of genetic manipulation, and availability of transgenic fluorescent lines facilitate the study of pigmentation. This study employs the use of wild-type and transgenic zebrafish lines that drive green fluorescent protein (GFP) expression under mitfa and tyrp1 promoters that mark various stages of melanocytes. 
Morpholino-based silencing of candidate genes is achieved to evaluate the phenotypic outcome on larval pigmentation and is applicable to screen for regulators of pigmentation. This protocol demonstrates the method from microinjection to imaging and fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based dissection of phenotypes using two candidate genes, carbonic anhydrase 14 (Ca14) and a histone variant (H2afv), to comprehensively assess the pigmentation outcome. Further, this protocol demonstrates segregating candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators that selectively alter melanocyte numbers and melanin content per cell, respectively.

Regulators of melanocyte functions govern visible differences in the pigmentation outcome. Deciphering the molecular function of the candidate pigmentation gene poses a challenge. Herein, we demonstrate the use of a zebrafish model system to identify candidates and classify them into regulators of melanin content and melanocyte number.

النهج الجيني العكسي لتحديد منظمات التصبغ باستخدام الزرد

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

منهج في استخراج أصباغ من الحبار

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

مختبر الأحيائي تغذية الأسماك لتقييم آخر Antipredatory من المركبات الثانوية من الأنسجة من الكائنات البحرية

قياس التصبغ البطن في

الماء في مستحلب النفط: نظام جديد لتجميع البروتينات ملزم الكلوروفيل المياه القابلة للذوبان مع أصباغ مسعور

عزل وإدماج هوائيات حصاد الضوء من دياتوم مينيغينيانا سيكلوتيلا في الدهنية مع الدهون ثايلاكويد

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

تنقية النصوص والأيضات من

في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء

أساليب لفترات الخوادر التدريج والقياس للجناح تصبغ المورفولوجية جوتيفيرا

النهج الجيني العكسي لتحديد منظمات التصبغ باستخدام الزرد