The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

Les expériences avec des souris étaient conformes à la loi allemande et la Société allemande pour les directives de Neurosciences de l&#39;élevage. Les soins des animaux et de l&#39;utilisation des comités de la Ruhr-Universität Bochum ont accordé les permis appropriés. 1. Préparation et culture de corticale astrocytes Remarque: Effectuez ces étapes du protocole au moins 7 jours avant de procéder aux étapes suivantes, comme les cultures d&#39;astrocytes devraient se développer en monocouches confluentes avant que les neurones sont préparés. astrocytes primaires sont dérivées de cultures gliales mélangées obtenues à partir souriceaux autour jour post-natal (P) 0-3. Trois cerveaux corticales (6) par flacon T75 doivent être utilisés. <ol><li> Préparer le milieu des astrocytes en complétant milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% v / v de sérum de cheval et 0,1% v / v de gentamycine dans des conditions stériles. Conserver le milieu à 4 ° C pendant 2 semaines. </li><li> Manteau 3x T75 flacons wie 10 pg / ml de poly-D-lysine (PDL, dans l&#39; eau de culture cellulaire grade) pendant au moins 1 h à 37 ° C en présence de 6% v / v de CO 2. Après le revêtement, lavez les flacons deux fois avec un tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer les cations non liés, et ajouter 9 ml de milieu d&#39;astrocytes. </li><li> Pour la préparation du cerveau, ajouter une solution saline équilibrée de Hank 10 ml (HBSS) jusqu&#39;à 1 x 10 cm de boîte de Pétri et 1 ml de HBSS à 1x 15 ml tube (quel que soit le nombre de cerveaux qui sera utilisé). Gardez une paire de ciseaux chirurgicaux, 2 pinces fines et une paire de jumelles à la portée de la procédure. </li><li> Décapitez 3 chiots rapidement avec les ciseaux chirurgicaux et de recueillir les têtes dans une boîte de 10 cm vide. <ol><li> Effectuer la préparation des corticales sous la binoculaire. En utilisant deux pinces fines, enlever la peau dorsale du crâne sur la ligne médiane, à partir du cou vers le haut vers le niveau des yeux. Par la suite, le cerveau et ses vaisseaux sanguins est visible sous le crâne. </li><li>Fixer la tête à l&#39;extrémité rostrale avec une paire de pinces et incise la ligne médiane du crâne, à partir de l&#39;extrémité postérieure. Par la suite, un clip au large de la droite et les moitiés gauche du crâne pour exposer le cerveau. </li><li> Fermez la pointe de la pince et le positionner ventralement sous le cerveau. Soulevez le cerveau sur le crâne et le transférer dans le plat HBSS rempli 10 cm de Pétri. Procédez de la même manière avec l&#39;échantillon restant jusqu&#39;à ce que tous les cerveaux sont rassemblés dans le plat. </li></ol></li><li> Après avoir recueilli les cerveaux, commencer par la séparation des corticales par pincement le cerveau postérieur en utilisant une paire de pinces, comme une paire de ciseaux. Effectuer une incision médiane entre les deux hémisphères avec une paire de forceps. Fixez soigneusement le cerveau avec une pince et couper le mésencéphale et les bulbes olfactifs à l&#39;aide d&#39;un deuxième pince pour se retrouver avec les moitiés corticales. </li><li> Fixer la moitié corticale avec une paire de pinces et éplucher les méninges des hémisphères en les détachant felon le bord latéral, puis en les tirant de la surface corticale à l&#39;aide d&#39;un second forceps. </li><li> Retournez la moitié corticale avec sa surface orientée vers le bas vers le plat; soigneusement disséquer et retirer l&#39;hippocampe en forme de croissant à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces. Transférer les corticales simples dans le tube 15 ml conique en utilisant une pince fermée pour porter un cortex individuel. </li><li> Après avoir recueilli tous les corticales, de transit à la hotte à flux laminaire stérile et commencer les préparatifs de la dissociation du tissu cortical. </li><li> Ajouter 1 mL de DMEM à un tube réactionnel 2 ml et on ajoute 0,1% p / v de la papaïne (30 unités). Incuber la suspension dans un bain d&#39;eau à 37 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;une solution clarifiée se développe (environ 3 minutes). Ajouter 0,24 mg / mL L-cystéine et 20 pg / ml de DNAse et agiter doucement. Remarque: Pour la digestion, environ 1 ml de solution d&#39;enzyme est nécessaire. </li><li> Filtre (0,22 um de taille des pores) pour obtenir une solution stérile de 1 mL avant d&#39;ajouterau tissu cortical. Incuber les tubes pendant 30 min - 1 heure à 37 ° C ( par exemple, dans un bain d&#39;eau). REMARQUE: Les étapes de 1,11 à 1,14 sont essentielles et devraient être achevés dans les 15 min. </li><li> Pour mettre fin à la réaction de digestion, ajouter 1 ml de milieu d&#39;astrocytes et triturer avec soin le tissu digéré à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 mL. Pour la trituration, la déplacer doucement sur le piston de la pipette, en aspirant ainsi l&#39;extrusion et la suspension de tissu cortical. </li><li> Une fois que le tissu a été dissocié en une suspension à cellule unique, ajouter 5 ml de milieu de astrocyte et centrifuger pendant 5 min à 216 x g. </li><li> Aspirer le surnageant avec précaution du culot résultant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu d&#39;astrocytes. </li><li> Ajouter les suspensions de cellules dans des flacons T75 réapprovisionnés avec 9 milieu de astrocyte mL (voir 1.2). </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans l&#39;incubateur en présence de 6% v / v de CO 2. Après 4 d, effectuer le premier changement de milieu complet (10 ml). Par la suite, changer le milieu de culture tous les 2 - 3 d. </li><li> Après 7 jours, vérifier si les cellules ont formé une monocouche confluentes. Sinon, attendre encore 2 - 3 jours jusqu&#39;à confluence complète de la culture est atteinte. REMARQUE: Les astrocytes présentent de grandes masses de cellules aplaties, localisent au fond du flacon et ne développent pas de processus cellulaires notables. Ils diffèrent des petites cellules progénitrices lumineuses à contraste de phase et la microglie se trouvant sur le dessus de la monocouche 17. </li><li> Afin de se débarrasser des cellules progénitrices et obtenir une culture d&#39;astrocytes pure, placer les flacons T75 sur un agitateur orbital et agiter les cultures O / N à 250 rpm. Veiller à ce que la température est réglée à 37 ° C et que le filtre de la fiole est scellée avec un film de laboratoire pour empêcher l&#39; évaporation du CO 2. </li><li> Le lendemain, aspirer le milieu et ajoutez milieu de culture frais 10 mL réapprovisionné avec 20 uM cytosine-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) à Eliminales cellules de séparation résiduelle Te. REMARQUE: l&#39; incubation avec de l&#39; AraC pour les 2 - 3 jours dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 6% de CO 2 se traduira par une culture d&#39;astrocytes pur. </li><li> Surveiller la pureté des cultures d&#39;astrocytes par inspection visuelle au microscope optique. Si résiduelle contraste de phase des cellules progénitrices lumineux et microglie résident toujours au - dessus de la monocouche astrocytaire 17 (voir l&#39; étape 1.16), répétez les étapes 1,18 et 1,19. NOTE: Le confluentes et monocouches d&#39;astrocytes purs peuvent être conservés jusqu&#39;à 14 jours dans l&#39;incubateur (37 ° C, 6% v / v de CO 2) avant de passer à l&#39;étape suivante. Changer la moitié du milieu tous les 3 jours. Ne pas recueillir, gel et de dégel des astrocytes, ces cellules vont perdre leurs propriétés de soutien neuronales à travers la procédure de stockage. </li></ol> 2. astrocytes Préparation pour la coculture indirecte Note: 48 - 72 h avant de préparer les neurones, les astrocytes de transfert à l&#39;celinserts l-culture. En règle générale, un seul flacon T75 délivre un nombre suffisant de cellules pour soutenir les cultures de neurones obtenus avec une préparation. <ol><li> Placez autant inserts au besoin dans 24 puits de plaques. Enrober chaque insert avec 10 pg / ml PDL (dissous dans de l&#39; eau de culture cellulaire grade) pendant environ 1 h à 37 ° C, 6% v / v de CO 2. Après l&#39;incubation, les inserts de lavage deux fois avec du PBS. Dans l&#39;intervalle, procéder à la préparation des astrocytes. NOTE: Les inserts remplis de PBS peuvent être conservés jusqu&#39;à ce que la suspension de cellules astrocytes est prêt à l&#39;emploi. </li><li> Aspirer le milieu de astrocyte (avec AraC) et laver la culture une fois avec 10 ml de PBS pour assurer tout sérum résiduel est éliminé. </li><li> Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) à 0,05% dans les flacons et on incube les cellules pendant trypsination à 37 ° C, 6% v / v de CO 2 pendant environ 10 min. </li><li> Contrôler le détachement des cellules par inspection visuelle à l&#39;aide d&#39;un microscope et facilitatE le détachement des cellules en tapant sur le côté des flacons contre le bureau. REMARQUE: Les étapes 02.05 à 02.08 sont critique et devrait être terminé sous 15 - 20 min. </li><li> À la suite de la trypsinisation doucement resuspendre les cellules dans 7 ml de milieu d&#39;astrocytes et de transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml. Centrifugeuse pendant 5 min à 216 x g. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu d&#39;astrocytes. </li><li> Compter les cellules en utilisant une chambre de comptage. </li><li> Remplissez le fond des puits de la-bien-plaque 24 avec 500 ul milieu astrocytes et transférer 25.000 cellules dans 500 pi de milieu de astrocyte dans chaque insert individuel. Incuber la culture à 37 ° C, 6% v / v de CO 2. NOTE: Après 42-72 h les cultures atteindra environ 100% de confluence. A ce stade , la pureté de la culture peut être contrôlée par immunocytochimie 11. Les cultures confluentes peuvent être maintenues pendant jusqu&#39;à 7 jours avant de procéder à l&#39;L&#39;étape suivante. Changer la moitié du milieu tous les 3 jours. </li></ol> 3. Préparation du primaire hippocampique Neurones Remarque: les neurones hippocampiques de souris primaires devraient être dérivées de E15.5 - E16 embryons de souris enceintes chronométrées. <ol><li> Préparer le milieu neurone (MEM pyruvate de sodium 10 mM, 0,1% p / v ovalbumine, 2% v / v milieu supplément B27 et 0,1% v / v de la gentamicine (stérilisée par filtration)), et le milieu de préparation (HBSS avec 0,6% en poids / v de glucose et 10 mM de HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-éthanesulfonique pipérazine)). Pré-équilibrer préchauffer et le milieu des neurones dans des flacons de filtre à 37 ° C, 6% v / v de CO 2. </li><li> Placez le verre-lamelles (diamètre 12 mm) dans les puits de 24 puits de plaques (utiliser les lamelles spéciales, qui sont entaillées pour l&#39;utilisation avec des inserts de culture cellulaire). <ol><li> Manteau pendant au moins 1 h avec 15 pg / ml Poly-DL-ornithine dans l&#39;eau (culture cellulaire de qualité) à 37 ° C. Utiliser au moins 500 pi par puits pour assurer queles lamelles sont complètement couverts. Laver les puits deux fois avec PBS. Laissez le PBS dans les puits jusqu&#39;à ce que l&#39;étalement des cellules. Veiller à ce que les puits ne sèchent pas. </li></ol></li><li> Pour disséquer les hippocampes, préparer 3x 10 cm plats remplis de milieu de préparation et 1x tube 2 ml avec 1 ml milieu de préparation. Préparer des ciseaux et 2 pinces fines. </li><li> Sacrifiez la souris enceinte par dislocation cervicale, stériliser l&#39;abdomen par lavage avec 70% v / v d&#39;éthanol, et d&#39;ouvrir l&#39;abdomen à l&#39;aide des ciseaux pointus. Exciser l&#39;utérus de perles soigneusement avec des ciseaux et transférer l&#39;organe en 1x boîte de 10 cm rempli de milieu de préparation. </li><li> Ensuite, retirez les embryons de l&#39;utérus. inciser soigneusement l&#39;utérus et retirer l&#39;amnios sans nuire aux embryons en utilisant 2 pinces. Par la suite, décapite chaque embryon avec une paire de ciseaux et transférer les têtes dans une seconde boîte de 10 cm fourni avec milieu de préparation. </li><li> Procéder à la préparation des têtes (similaire à la préparation décrite dans 1,4 à 1,7). <ol><li> Immobiliser la tête avec une paire de pinces et inciser le crâne et la peau dans la région du cou à proximité du rhombencéphale, perpendiculaire à l&#39;axe cérébro-spinal. Utilisez une deuxième paire de pinces pour soulever deux crâne et la peau recouvrant, et pliez la calotte crânienne douce vers la fin rostrale de la tête, exposant ainsi le cerveau. </li><li> Avec l&#39;aide de 2 pinces, détacher le cerveau de la cavité crânienne. Pour cela, fermer 1 paire de pinces faire et séparer le cerveau du crâne à partir de bulbes olfactifs et se déplaçant vers le rhombencéphale. Recueillir les cerveaux dans une autre boîte de 10 cm rempli de milieu de préparation. </li></ol></li><li> Disséquer les hippocampes des fragments de cortex, comme décrit ci-dessus pour la préparation des astrocytes (étape 1.6). Retirez le hippocampes de chaque hémisphère et les recueillir dans le tube 2 mL rempli de milieu de préparation. </li><li> Après avoir terminé la dissection, transférer le tube sur le banc stérile à flux laminaire et Digest le tissu hippocampique avec 1 solution de digestion ml contenant de la papaïne. Préparer la solution de digestion comme décrit à l&#39;étape 1/9 à 1/10, mais utiliser MEM à la place DMEM. REMARQUE: Les étapes 03.09 à 03.12 sont essentielles et devraient être achevés dans les 10 - 15 min. </li><li> Après l&#39;achèvement de la digestion, retirer avec soin la solution de digestion par aspiration douce avec une pipette. </li><li> Laver le hippocampes 3 fois avec un milieu de neurone en ajoutant séquentiellement et ensuite aspirer soigneusement 1 ml de milieu de culture frais par cycle de lavage. Ne pas centrifuger la suspension cellulaire. </li><li> Après l&#39;étape finale de lavage, on triture soigneusement le tissu dans 1 ml de milieu neuronal. </li><li> Compter les cellules en utilisant une chambre de comptage et de la plaque 35.000 cellules dans 500 ul de milieu de neurone par un seul puits d&#39;une 24 bien-plaque (la plaque mentionnée au point 3.2). NOTE: En option, une partie aliquote de cellules peut être de contraste avec le bleu trypan pour évaluer la vitalité de la préparation cellulaire. Contrôle de la densité de placage par inspection visuelleion à l&#39;aide du microscope (typiquement 90 - 110 cellules par champ visuel d&#39;un objectif 10X standard). </li><li> Placer les neurones dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 6% v / v de CO 2 pendant 1 h. </li><li> Diffusez incubation, prendre les inserts préparés (ensemencées avec des monocouches confluentes astrocytes) hors de l&#39;incubateur (voir étape 2.8). Remplacez le milieu par aspiration du milieu astrocytes et le remplacer par 500 ul de milieu de neurone frais. NOTE: Les inserts doivent abriter des monocouches d&#39;astrocytes confluentes après 2 - 3 DIV (Days In Vitro). </li><li> Placez les inserts avec astrocytes avec précaution dans les puits qui contiennent les cultures de neurones (étape 3.13) à l&#39;aide de pinces stériles. </li><li> Placez le neurone indirect-astrocyte coculture résultant de nouveau dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 6% v / v CO 2. NOTE: Dans ces conditions, les neurones peuvent être cultivées pendant jusqu&#39;à 4 semaines dans un milieu complètement défini. Aucun changement de milieu est nécessaire. Pour les cultures de longue date, il est recommandé de remplir epuits mpty avec de l&#39;eau stérile afin de réduire l&#39;évaporation du puits-plaque 24. </li><li> Effectuer des analyses in vitro cellulaire après des périodes de culture souhaitée (par exemple, pour immunocytochimie, PCR, Western blot, les enregistrements électrophysiologiques (clamp patch ou tableau multiélectrodes)) 7,15,18. NOTE: Le système de culture est également adapté pour le traitement pharmacologique aiguë et chronique des cultures 11. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signals+of+plasticity+at+the+tetrapartite+synapse.">Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse.</a> Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse.</a> JoVe. , (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;objectif principal du protocole actuel est de cultures neuronales et astrocytaires complètement séparés, tout en les maintenant dans un milieu partagé. Pour cette raison, la pureté des cultures obtenues doivent être vérifiées au début de la procédure. Nous recommandons l&#39;utilisation de la tubuline spécifique des neurones, neurofilaments ou protéine NeuN comme marqueurs neuronaux, GFAP comme marqueur astrocytaire, antigène O4 comme marqueur de précurseurs d&#39;oligodendrocytes et de protéines Iba1 pour identifier les microglies. Portez une attention particulière lors de l&#39;exécution d&#39;une étape critique du protocole, tel que spécifié par un &#39;NOTE&#39; avant la description de l&#39;étape. Prendre en considération que les deux cultures primaires de neurones et les astrocytes sont assez sensibles. Par conséquent, plusieurs problèmes peuvent survenir au début de la procédure. Si les astrocytes ne parviennent pas à une monocouche confluente dans des flacons T75 après 10 DIV (section 1 du protocole), vérifier les composants du milieu des astrocytes (date de péremption). En outre,augmenter la quantité de tissu cortical préparé pour initier la culture (jusqu&#39;à 10 corticales par flacon). Si les astrocytes ne parviennent pas à une monocouche confluentes sur des inserts de culture cellulaire après 72 h (section 2 du protocole), vérifier les composants du milieu des astrocytes et PDL (date de péremption) .Essayez à l&#39;assiette des cultures fraîchement préparées, déterminer la proportion de viable cellules avant le placage et d&#39; ajuster le nombre de cellules en conséquence (par exemple, utiliser contre - coloration au bleu trypan). Si la faible survie des neurones est détectée au bout de 24 h, le tissu de l&#39;hippocampe n&#39;a pas été suffisamment doucement trituré (protocole étape 3.11) .Pay attention à éviter la formation de bulles lors de la dissociation du tissu. Si la survie des neurones est significativement abaissé après 7 - 14 DIV et si les neurones forment des agrégats de 3 - 5 cellules après 7 DIV, utilisez fraîchement inserts préparé avec des astrocytes, vérifier la pureté des astrocytes par immunocytochimie, et vérifier les composants du milieu des neurones. Si de grands agrégats de neurones (plus de 10 cellules) sont cisible, il est possible que le tissu de l&#39;hippocampe a été trituré pas suffisamment, ce qui entraîne une dissociation incomplète (protocole étape 3.11). Faites attention à la suspension d&#39;homogénéité. Si la culture neuronale est contaminée avec des cellules non-neuronales (microglies, les astrocytes, des cellules précurseurs d&#39;oligodendrocytes, etc.), supprimer complètement le tissu cortical voisin adjacent à l&#39;hippocampe (étape 3.7) et aussi vérifier les composants du milieu des neurones. La coculture indirecte proposée de neurones primaires et astrocytes fournit un outil polyvalent pour l&#39;enquête à long terme des interactions neurone-glie. Surtout, ce protocole est optimisé pour les cellules de souris, ce qui ouvre la perspective de la mise en oeuvre des modèles génétiques de souris. En raison de la séparation physique complète des types de cellules 2, les neurones et les astrocytes de génotypes distincts peuvent être combinées de la manière souhaitée. Parmi de nombreuses applications, cette approche peut être utilisée pour investigate développement des réseaux neuronaux, synaptogenèse, l&#39;activité du réseau et de signalisation astrocyte-neurone. Bien que la coculture indirecte des neurones et des astrocytes ouvre de vastes possibilités pour leur analyse séparée et la signalisation à longue distance, l&#39;absence de contact direct peut compromettre la régulation subtile de la plasticité synaptique 22. Ainsi, le manque d&#39;interaction entre les saillies astrocytaires et synapses neuronales a à traiter avec soin lors de l&#39;utilisation de ce modèle. L&#39;essai est basé sur deux protocoles antérieurs pour astrocytes et les préparations neuronales 14,17 et a été amélioré au cours des dernières années. L&#39;approche à l&#39; origine a été établie pour la souris et le rat 7 11 cellules. Publications antérieures du laboratoire fournissent une caractérisation détaillée des essais concernant la survie des cellules, la formation des synapses et la caractérisation électrophysiologique des cellules résultantes 7,11,15,18. En outre, le til dosage peut être adapté à d&#39; autres paramètres, tels que les micro-électrodes-réseaux (AME) 7. Pour les applications futures, le lecteur doit tenir compte d&#39; autres protocoles pour l&#39;examen détaillé de la formation des synapses 23, ainsi que pour l&#39; analyse des MEA in vitro. En conclusion, le dosage fournit un outil polyvalent pour les laboratoires axés sur différents aspects des interactions neurone-glie.

Tout au long des dernières décennies, l&#39;interprétation générale de la fonction névroglie a évolué à partir de l&#39;attribution d&#39;un soutien simplement vers un rôle actif réglementaire concernant la fonction neuronale 1. En raison de leur impact important sur le cerveau homéostasie dans la santé et la maladie 2, astrocytes sont d&#39; un intérêt particulier pour la communauté scientifique. Au cours des dernières années, une diversité d&#39;études ont porté sur les interactions neurone-glie in vivo et in vitro 3. Cependant, la plupart des systèmes de culture ne permettent pas l&#39;analyse séparée des deux types de cellules et de leurs secrétomes respectifs. Plusieurs approches exploitent la coculture directe des neurones et des cellules gliales pour atteindre la survie à long durable et le développement du réseau neuronal physiologiquement pertinents 4-6. Le présent protocole atteint les mêmes objectifs tout en gardant les deux types de cellules physiquement séparés 7. Par rapport à conditionemoyen d approches 8,9, notre système permet d&#39;étudier la communication bidirectionnelle entre les neurones et les astrocytes. L&#39;expression des molécules de signalisation sécrétées peut être surveillée tandis que les cellules dans le milieu maturate partagé. Cette possibilité est particulièrement importante, car les astrocytes libèrent des facteurs solubles tels que les cytokines, les facteurs de croissance et des molécules de la matrice extracellulaire 10,11, régulant ainsi la croissance neuronale et fonctionnent de 7,12. Ainsi, il a été démontré que l&#39;addition de la thrombospondine aux cellules ganglionnaires de la rétine in vitro induit la formation de synapses 13. Cependant, d&#39; autres facteurs encore inconnus sont nécessaires pour rendre les synapses fonctionnelles 13. En outre, les molécules libérées par les astrocytes doivent être identifiés afin de comprendre la base des interactions neurone-glie. La culture des neurones primaires et des astrocytes de rat et la souris a été décrit précédemment 14-16. ici, nousprésenter un outil élégant et polyvalent de combiner les deux types de cellules dans une approche indirecte de coculture. Étant donné que les deux cultures sont physiquement séparés encore partager le même milieu, l&#39;impact des neurones, des astrocytes et des molécules solubles, peuvent être analysées séparément, créant ainsi un outil puissant pour les études d&#39;interaction neurone-glie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:115px;">Reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">B27</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">17504-044</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">Cytosine-&#223;-D arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C1768</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317, H361</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DMEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">DNAse</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">LS002007</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">G1397</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317-334</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Glucose</td>
			<td style="width:152px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">22700</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HBSS</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">14170-088</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">15630-056</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Horse serum</td>
			<td style="width:152px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:151px;">S9135</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C-2529</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">MEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">31095-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A7641</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H334</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Papain</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">3126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">PBS</td>
			<td style="width:152px;">self-made&#160;</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0899</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P3655</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">S8636</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Equipment</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">24 well plates</td>
			<td style="width:152px;">Thermoscientific/Nunc</td>
			<td style="width:151px;">142475</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">24-wells plate (for the&#160; indirect co-culture)</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353504</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Binocular</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">MZ6</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Cell-culture inserts</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353095</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Counting Chamber</td>
			<td style="width:152px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:151px;">650010</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Forceps</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont (#5)</td>
			<td style="width:151px;">11254-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">glass cover slips (12 mm)</td>
			<td style="width:152px;">Carl Roth (Menzel- Gl&#228;ser)</td>
			<td style="width:151px;">P231.1</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Incubator</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Heracell 240i</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Micro tube (2 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">72,691</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">DMIL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Millex Syringe-driven filter unit</td>
			<td style="width:152px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:152px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Innova 4000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Parafilm</td>
			<td style="width:152px;">Bemis</td>
			<td style="width:151px;">PM-996</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Petri dishes (10 cm)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,902</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">pipette (1 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">Pipetman 1000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sterile work bench</td>
			<td style="width:152px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:151px;">Laminar Flow SterilGARD III</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:151px;">14094-11</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Syringe</td>
			<td style="width:152px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:151px;">9003016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">T75 flask</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,911,002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">tube (15 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">64,554,502</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Water bath</td>
			<td style="width:152px;">GFL</td>
			<td style="width:151px;">Water bath type 1004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

le développement neuronal et la fonction est la condition préalable du développement et le cerveau adulte. Cependant, les mécanismes sous-jacents de la formation hautement contrôlé et l&#39;entretien des réseaux neuronaux complexes ne sont pas complètement compris jusqu&#39;à présent. Les questions ouvertes concernant les neurones dans la santé et la maladie sont diverses et allant de la compréhension du développement de base aux enquêtes sur les droits liés à des pathologies, par exemple, les maladies et la schizophrénie d&#39;Alzheimer. L&#39;analyse la plus détaillée de neurones peut être réalisé in vitro. Cependant, les neurones exigent des cellules et ont besoin du soutien supplémentaire de astrocytes pour leur survie à long terme. Cette hétérogénéité cellulaire est en conflit avec le but de disséquer l&#39;analyse des neurones et des astrocytes. Nous présentons ici un essai de culture cellulaire qui permet la co-culture à long terme des neurones et des astrocytes primaires pures, qui partagent le même milieu chimiquement défini, tout en étant physiquementséparé. Dans cette configuration, les cultures survivent jusqu&#39;à quatre semaines et le dosage est adapté à la diversité des enquêtes concernant les interactions neurone-glie.

L&#39;analyse des cultures de neurones par l&#39;intermédiaire du système de co-culture indirecte est multiple et peut être effectuée à différents stades de la maturation de la culture. En raison du fait que les cellules peuvent être maintenues pendant jusqu&#39;à 4 semaines, des études à long terme des cultures sont possibles. Le schéma dans le panneau gauche du milieu de la figure 1 montre la configuration de coculture. Avec l&#39;utilisation de ce système, imagerie des cellules vivantes des deux types de cellules peut être réalisée, comme illustré par contraste de phase images de la monocouche d&#39;astrocytes (panneau en haut à gauche) et le réseau neuronal (panneau en bas à gauche). Après fixation, l&#39;évaluation immunocytochimique est possible, comme le montre en haut à droite et en bas à droite des panneaux. Neurones commencent à établir des connexions synaptiques à partir d&#39;environ 7 DIV dans notre modèle (données non présentées). Par 14 DIV multiples synapses sont formées au sein des réseaux neuronaux, tels que définis par la détection immunocytochimique combinée des marqueurs pré et post - synaptiques (figure 1, le panneau en bas à droite). Il est important, non seulement la quantité de marqueur synaptique puncta peut être visualisée et quantifiée en utilisant cette approche, mais aussi la structure achevée synapses, qui sont les plus susceptibles de contribuer à la connectivité réseau. Les cultures d&#39;astrocytes fournissent non seulement un soutien trophique pour les neurones 11, mais synthétisent également plusieurs facteurs sécrétés 19,20 impliqués dans la plasticité neuronale. L&#39;expression d&#39;un de ces facteurs, à savoir la matrice métalloprotéinase 2 (MMP2), est mise en évidence dans le panneau supérieur droit de la figure 1. Fait intéressant, 2 MMP2-isoformes distincts ont été détectés dans le milieu de coculture utilisant Western Blot (figure 1, panneau central droit ). Potentiellement astrocytes sécrètent MMP2 dans les smoyen Hared, affectant ainsi la plasticité neuronale. Aussi plusieurs isoformes de ténascine-C, un régulateur connu de la croissance axonale, la migration et la différenciation cellulaire 21 ont été identifiés. Pris ensemble, ces résultats montrent deux exemples et fournir ainsi une preuve de principe pour la variété des enquêtes d&#39;astrocytes, des neurones et leur communication réciproque, qui peut être réalisée selon la méthode de co-culture indirecte décrite ici. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54757/54757fig1.jpg" /> . Figure 1: Le indirect Astrocyte-Neuron système coculture permet une analyse séparée des astrocytes, sécrétées Médiateurs moléculaires Neurosciences Panneau supérieur gauche: les astrocytes forment des monocouches sur la membrane insert de culture cellulaire, le contraste de phase; barre d&#39;échelle: 250 microns Panneau supérieur, à droite:. commetrocytes sont immunocolorées pour gliale acide fibrillaire Protein (GFAP) (souris clone GA5) et Matrix métalloprotéases 2 (MMP2) (polyclonaux de lapin); barre d&#39;échelle:. 250 microns Panneau central, à gauche: le schéma illustre la configuration indirecte de coculture. Bien que deux cultures sont séparés physiquement, ils partagent le même médium Panneau central, à droite:. Deux médiateurs moléculaires sécrétées des interactions neuronales-glie sont révélés dans le milieu de co-culture en utilisant Western blot. . Isoformes multiples de ténascine C (TNC), un régulateur de croissance des neurites, et MMP2, un modificateur de matrice extracellulaire, sont documentés panneau bas, à gauche: neurones primaires développent des réseaux très interconnectés par le 14 e jour de la culture, le contraste de phase; . barre d&#39;échelle: 250 microns panneau bas, à droite: à partir de 14 d in vitro, plusieurs connexions synaptiques sont établies entre les neurones, comme détecté par marquage immunocytochimique; barre d&#39;échelle: 50 microns. La co-localisation du marqueur présynaptique Basson (lapin polyclonaux) avec la protéine postsynaptique PSD95 d&#39;échafaudage (clone de la souris 6G6-1C9) documente la formation des synapses structurellement terminée. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54757/54757fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Ce protocole décrit la coculture neurone-astrocyte indirect pour l&#39;analyse compartimentée des interactions neurone-glie.

Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Mise en place pour l&#39;investigation détaillée des interactions Neuron-glie

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K vues.  Ruhr-University.  Ce protocole décrit la coculture neurone-astrocyte indirect pour l'analyse compartimentée des interactions neurone-glie. 

Vidéo: The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Observing Virtual Social Interactions

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language affect our decisions in personal and professional life alike 1. These "friend or foe" judgements are often based on first impressions, which in turn may affect our decisions to "approach or avoid". Previous studies investigating the neural correlates of social cognition tended to use static facial stimuli 2. Here, we illustrate an experimental design in which whole-body animated characters were used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) recordings. Fifteen participants were presented with short movie-clips of guest-host interactions in a business setting, while fMRI data were recorded; at the end of each movie, participants also provided ratings of the host behaviour. This design mimics more closely real-life situations, and hence may contribute to better understanding of the neural mechanisms of social interactions in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in social behaviour in such clinical conditions as social anxiety and autism 3.

This article demonstrates an experimental design in which whole-body animated characters are used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) to investigate the neural correlates of observing virtual social interactions.

Investigation d&#39;imagerie cérébrale de les corrélats neuraux de l&#39;observation virtuelle Interactions sociales

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language ...

Recherche

Neurosciences

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

Investigation d&#39;imagerie cérébrale de l&#39;effet de mémoire-Amélioration de l&#39;émotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Investigation d&#39;imagerie cérébrale de l&#39;effet de nuire à l&#39;émotion sur la cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form during the earliest stages of brain development and are maintained throughout the animal's life. The brain ventricular system is found in vertebrates, and the ventricles develop after neural tube formation, when the central lumen fills with cerebrospinal fluid (CSF) 1,2. CSF is a protein rich fluid that is essential for normal brain development and function3-6.
In zebrafish, brain ventricle inflation begins at approximately 18 hr post fertilization (hpf), after the neural tube is closed. Multiple processes are associated with brain ventricle formation, including formation of a neuroepithelium, tight junction formation that regulates permeability and CSF production. We showed that the Na,K-ATPase is required for brain ventricle inflation, impacting all these processes 7,8, while claudin 5a is necessary for tight junction formation 9. Additionally, we showed that "relaxation" of the embryonic neuroepithelium, via inhibition of myosin, is associated with brain ventricle inflation.
To investigate the regulation of permeability during zebrafish brain ventricle inflation, we developed a ventricular dye retention assay. This method uses brain ventricle injection in a living zebrafish embryo, a technique previously developed in our lab10, to fluorescently label the cerebrospinal fluid. Embryos are then imaged over time as the fluorescent dye moves through the brain ventricles and neuroepithelium. The distance the dye front moves away from the basal (non-luminal) side of the neuroepithelium over time is quantified and is a measure of neuroepithelial permeability (Figure 1). We observe that dyes 70 kDa and smaller will move through the neuroepithelium and can be detected outside the embryonic zebrafish brain at 24 hpf (Figure 2).
This dye retention assay can be used to analyze neuroepithelial permeability in a variety of different genetic backgrounds, at different times during development, and after environmental perturbations. It may also be useful in examining pathological accumulation of CSF. Overall, this technique allows investigators to analyze the role and regulation of permeability during development and disease.

We describe a live whole animal quantitative measurement for permeability of the embryonic zebrafish brain. The technique analyzes the ability to retain cerebrospinal fluid and molecules of different molecular weights within the neural tube lumen and quantifies their movement out of the ventricles. This method is useful for determining differences in epithelial permeability and maturation during development and disease.

Un test de perméabilité du neuro-épithélium embryonnaire poisson zèbre

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle pour l&#39;étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In Vitro Dosage pour l’étude de l’agrégation de la protéine Tau et de dépistage des drogues

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un

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Investigation d'imagerie cérébrale de les corrélats neuraux de l'observation virtuelle Interactions sociales

Investigation d'imagerie cérébrale de l'effet de mémoire-Amélioration de l'émotion

Investigation d'imagerie cérébrale de l'effet de nuire à l'émotion sur la cognition

Visualisation des propriocepteurs dans

Un test de perméabilité du neuro-épithélium embryonnaire poisson zèbre

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d'hippocampe

Un

In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

Méthode électrophysiologique de réponses d'enregistrement intracellulaire tension de

In Vitro Dosage pour l’étude de l’agrégation de la protéine Tau et de dépistage des drogues