The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

マウスを用いた実験では、畜産の神経科学のガイドラインについては、ドイツの法律とドイツ社会に従いました。ルール大学ボーフムの動物の世話と利用委員会が適切な許可を付与しています。 1.準備と皮質アストロサイトの栽培注：ニューロンが用意されている前に、星状細胞培養物がコンフルエントな単層に策定すべきであるとして、次のステップに進む前に、プロトコル、少なくとも7日間のこれらのステップを完了して下さい。初代星状細胞は、生後日（P）0-3の周りの仔マウスから得られた混合グリア培養物から誘導されます。 T75フラスコあたり3頭（6皮質）が使用されます。 <ol><li>無菌条件下で10％v / vのウマ血清および0.1％（v / v）のゲンタマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補完することにより、星状細胞培地を準備します。 2週間まで4℃でメディアを保管してください。 </li><li>コート3倍T75フラスコののwi6％（v / v）のCO 2の存在下、37℃で少なくとも1時間;（細胞培養グレードの水中でPDL）を10μg/ mLのポリ-D-リジン番目。コーティング後、結合していない陽イオンを除去し、9 mLの星状細胞培地を追加するためにリン酸緩衝食塩水（PBS）で2回フラスコを洗浄します。 </li><li>脳の調製のために、（関係なく使用される脳の数の）15 mLチューブを1Xに10センチメートルペトリ皿と1 mLのHBSSを1Xに10 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を追加します。手術用はさみ、2細かい鉗子と手続きのための手の届くところに双眼鏡のペアを保管してください。 </li><li>手術用ハサミで素早く3仔を刎ねると、空の10cmの皿に頭を収集します。 <ol><li>両眼の下の皮質の準備を行います。 2微細な鉗子を使用して、目のレベルに向かって首アップから始まる、正中線で頭蓋骨から背部皮膚を削除します。その後、その血管と脳は、頭蓋骨の下に表示されます。 </li><li>ピンセットで吻側端に頭を修正し、頭蓋骨の正中線を切開、後端から始まります。その後、脳を公開する権利と頭蓋骨の左半分をオフにクリップ。 </li><li>鉗子の先端を閉じて、脳の下に腹側にそれを配置します。頭蓋骨から脳を持ち上げ、HBSSに満ちた10センチメートルペトリ皿にそれを転送します。すべての脳を皿に収集されるまで、残りの検体と同じように進んでください。 </li></ol></li><li>脳を収集した後、ハサミのような鉗子のペアを使用して後脳からつまんで皮質の分離で始まります。鉗子の1組と2つの半球間の正中切開を行います。慎重に鉗子で脳を固定し、中脳皮質の半分で終わるために第2の鉗子を使用して、嗅球を遮断します。 </li><li>鉗子の1ペアで1皮質の半分を修正して、fは、それらを取り外すことにより半球から髄膜を剥離横方向のエッジをROM、その後、第二の鉗子を使用して、皮質表面からそれらを引きます。 </li><li>皿に向かって下方に向き、その表面に皮質の半分を反転。慎重に鉗子の一組を使用して、三日月状海馬を解剖し、削除します。個々の皮質を運ぶために1つの閉じた鉗子を使用して円錐形の15 mLチューブに単一の皮質を転送します。 </li><li>すべての皮質を収集した後、無菌層流フードへのトランジットと皮質組織の解離のための準備を始めます。 </li><li> 2 mLの反応管に1mLのDMEMを加えるとvのパパイン（30単位）/ wの0.1％を追加します。清澄溶液を（約3分）を発症するまで37℃の水浴中で懸濁液をインキュベートします。 0.24ミリグラム/ mLのL-システインおよび20μg/ mLのDNA分解酵素を加え、穏やかに振ります。 注：消化のために、酵素溶液約1ミリリットルが必要です。 </li><li>加える前に1 mLの滅菌溶液を得るために、フィルタ（0.22μmの孔径）それ皮質組織へ。 （水浴において、すなわち 、）、37℃で1時間- 30分間チューブをインキュベートします。 注：1.11ステップ - 1.14は重要であり、15分以内に完了する必要があります。 </li><li>消化反応を終了するには、1 mLのアストロサイト培地を追加し、慎重に1 mLのピペットを用いて消化された組織を粉砕します。トリチュレーションのために、優しく、それによって吸引し、皮質組織懸濁液を押し出し、ピペットプランジャーを移動します。 </li><li>組織を単細胞懸濁液に解離された後、216×gで5分間、5mLの星状細胞培地と遠心分離機を加えます。 </li><li>得られたペレットから慎重に上清を吸引除去し、1 mLのアストロサイト培地中で細胞を再懸濁。 </li><li> 9 mLのアストロサイト培地（1.2を参照）を補充T75フラスコに細胞懸濁液を追加します。 </li><li> 6％v / vのCO 2の存在下でのインキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。 4日後、（最初の完全な培地交換を行います10mL）で。 3日 - その後、培養液ごとに2を変更します。 </li><li>細胞がコンフルエントな単層を形成した場合は7日後、確認してください。文化の完全な合流が達成されるまで3日 - いない場合は、別の2を待ちます。 注：アストロサイトが大きい扁平な細胞体を表示するには、フラスコの底に局在し、顕著な細胞プロセスを開発することはありません。彼らは、単層17の上に常駐する小さな位相コントラスト明るい前駆細胞およびミクログリアは異なります。 </li><li>前駆細胞を取り除くと、純粋なアストロサイトの文化を取得し、オービタルシェーカー上でT75フラスコを置き、250rpmで培養O / Nを振るするために。温度を37℃に調整し、フラスコのフィルタは、CO 2の蒸発を防止するために、実験用フィルムで密封されていることをされていることを確認してください。 </li><li> eliminaに20μMのシトシン-1-β-D-アラビノフラノシド（AraCの）を補充翌日、培地を吸引し、10 mLを加え、新鮮な培地TE残留分割細胞。 注：2のためのAraCとのインキュベーション- 37℃のインキュベーターで3 dは、6％CO 2は、純粋なアストロサイトの文化になります。 </li><li>光学顕微鏡下での目視検査により星状細胞培養物の純度を監視します。残留位相コントラスト明るい前駆細胞およびミクログリアはまだアストロサイト単分子層17の上に存在する場合、繰り返しは1.18と1.19ステップ（ステップ1.16参照）。 注：コンフルエントと純粋な星状細胞単層は、次のステップに進む前に、インキュベーター内で最大14日（37℃、6％v / vのCO 2）で維持することができます。培地の半分を3日毎に変更してください。これらの細胞は格納手順を介して自分の神経細胞の支持特性を失うことになるとして、アストロサイトを、収集凍結と解凍しないでください。 </li></ol>間接共培養のためのアストロサイトの準備2 注：48から72時間をセルにニューロン、転送アストロサイトを準備する前にリットル培養インサート。一般的に、単一のT75フラスコは、1つの製剤を用いて得られた神経細胞培養をサポートするために十分な数の細胞を提供します。 <ol><li> 24ウェルプレートに必要な数のインサートを配置します。被膜37℃で約1時間の10μg/ mLのPDL（細胞培養グレードの水に溶解）とそれぞれのインサート6％（v / v）のCO 2。インキュベーション後、PBSで2回インサートを洗います。一方で、アストロサイトの準備を進めます。 注：アストロサイトの細胞懸濁液が使用可能になるまでPBSで満たされたインサートを保持することができます。 </li><li> （AraCを持つ）アストロサイト培地を吸引し、任意の残留血清が削除されていることを確認するために10 mLのPBSと文化1時間を洗います。 </li><li>フラスコに0.05％トリプシンEDTA（エチレンジアミン四酢酸）の3 mLを加え、約10分間、37℃、6％v / vのCO 2でのトリプシン処理のために細胞をインキュベートします。 </li><li>顕微鏡とfacilitaを使用して目視検査によって細胞の剥離を制御しますデスクトップに対するフラスコの側面をタップすることで細胞の剥離をTE。 注：2.5ステップ - 2.8が重要であり、15以内に終了する必要があります - 20分。 </li><li>トリプシン処理の後、穏やか7 mLの星状細胞培地中で再懸濁細胞を、15 mLの試験管に細胞懸濁液を移します。 216×gで5分間遠心分離します。 </li><li>注意深く上清を吸引し、1 mLのアストロサイト培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>計数チャンバーを用いて細胞を数えます。 </li><li> 500μLのアストロサイト培地で24ウェルプレートのウェルの底を記入し、各個々のインサートに500μLのアストロサイト培地中で25,000細胞を移します。 37°C、6％v / vのCO 2で培養物をインキュベートします。 注：42後 - 72時間培養物が約100％コンフルエンスに到達します。この段階で、培養物の純度は11免疫細胞化学によって確認することができます。コンフルエントな培養物に進むまでに7日間維持することができます次のステップ。培地の半分を3日毎に変更してください。 </li></ol>初代海馬ニューロンの調製注：プライマリマウスの海馬ニューロンはE15.5から導出されるべきである - 時限妊娠マウスのE16胚。 <ol><li> 0.6％とニューロン培地（10mMのピルビン酸ナトリウムとのMEM、0.1％W / Vオボアルブミン、2％（v / v）のB27培地補充物、0.1％（v / v）のゲンタマイシン（滅菌を濾過））、および調製培地（HBSSを準備/ワットVグルコースおよび10mMのHEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸））。前暖かく、37°C​​、6％（v / v）のCO 2でのフィルタフラスコ内で前平衡化ニューロン媒体。 </li><li> （細胞培養インサートで使用するための切り欠きされている特殊なカバースリップを使用）を24ウェルプレートのウェルにガラスカバースリップ（直径12mm）を配置します。 <ol><li> 37℃の水（細胞培養グレード）中の15μgの/ mLのポリDL-オルニチンを有する少なくとも1時間コート。ことを確実にするために、ウェルあたり少なくとも500μLを使用しますカバーガラスを完全に覆われています。 PBSでウェルを2回洗浄します。細胞をプレーティングするまでウェル中にPBSを残します。井戸が乾燥していないことを確認してください。 </li></ol></li><li>海馬を分析するには、準備媒体で満たされた3×10cmの皿と1 mLの準備培地で1×2 mLチューブを準備します。はさみと2細かい鉗子を準備します。 </li><li>頸椎脱臼により妊娠中のマウスを生け贄に捧げる、70％v / vエタノールで洗浄することにより腹部を殺菌し、鋭いハサミを使用して腹部を開きます。はさみで慎重にビーズの子宮を切除し、準備媒体で満たされた1×10cmの皿に臓器を移します。 </li><li>次に、子宮から胚を削除します。慎重に子宮を切開し、2鉗子を使用して胚を損なうことなく羊膜を除去します。その後、ハサミで各胚を刎ねると準備媒体が供給される第2の10cmの皿に頭を移します。 </li><li> preparに類似（ヘッドの準備に進みます1.7） - ationが1.4で説明しました。 <ol><li>ピンセットで頭を固定化し、中枢神経軸に垂直な後脳に近いネック領域に頭蓋骨と皮膚を切開。頭蓋骨と皮膚をカバー両方を持ち上げ、それによって脳を露出させ、頭の吻側端に向かって柔らかいスカルキャップを曲げるために鉗子の第二の対を使用してください。 </li><li> 2鉗子の助けを借りて、頭蓋腔から脳を切り離します。この鉗子の、1に近いペアを行うと、嗅球から始まり、後脳に向かって移動する頭蓋骨から脳を分離します。準備媒体で満たされた別の10cmの皿に脳を収集します。 </li></ol></li><li>アストロサイトの準備（ステップ1.6）のために上記のように皮質部分から海馬を解剖。各半球から海馬を取り出して、準備媒体で満たされた2 mLのチューブにそれらを収集。 </li><li>解剖を完了した後、無菌層流ベンチとdigesにチューブを移しますパパインを含む1mLの消化液と海馬組織をtは。 1.10、代わりにDMEMをMEMを使用する - ステップ1.9で説明したように消化溶液を準備します。 注：3.9ステップ - 3.12は重要であり、10以内に完了しなければならない - 15分。 </li><li>消化が完了した後、慎重にピペットで穏やかな吸引により消化溶液を引き出します。 </li><li>順次追加した後、慎重に洗浄サイクル当たり1 mLの新鮮な培養培地を吸引することによって、海馬をニューロン培地で3回洗浄します。細胞懸濁液を遠心しないでください。 </li><li>最後の洗浄工程の後、慎重に1mLのニューロン培地中で組織を粉砕します。 </li><li>計数チャンバーを用いて細胞をカウントし、24ウェルプレート（3.2で述べたプレート）の1ウェルあたり500μLニューロン培地中の35,000細胞をプレー。 注：必要に応じて、細胞のアリコートを細胞調製物の活力を評価するために、トリパンブルーで対比することができます。視覚的検査により、めっき密度を制御顕微鏡を用いたイオン（典型的には90 - 標準の10倍の対物レンズの視野あたり110細胞）。 </li><li> 37°C、1時間の6％v / vのCO 2のインキュベーターに入れニューロン。 </li><li> 、インキュベーションを投稿準備インサートを取るインキュベータのうち（コンフルエント星状細胞単層を播種）（ステップ2.8を参照してください）。アストロサイトの培地を吸引し、500μlの新鮮なニューロン培地に置き換えることにより、メディアを交換します。 注： - 3 DIV（in vitroでの日数）インサートは2の後、コンフルエント星状細胞単層を保有する必要があります。 </li><li>慎重に滅菌ピンセットを用いて、神経細胞培養（ステップ3.13）を含有するウェルにアストロサイトに挿入を置きます。 </li><li>バック、37℃、6％v / vのCO 2インキュベーター中に生じた間接的なニューロン、星状細胞共培養を置きます。 注：これらの条件下で、ニューロンが完全に定義された培地中で最大4週間培養することができます。いいえ培地交換は必要ありません。長期培養のためには、電子メールを記入することをお勧めします24ウェルプレートからの蒸発を低減するために、滅菌水でmpty井戸。 </li><li>実行in vitro細胞解析後の培養期間を希望する（ 例えば、免疫細胞化学、PCR、ウエスタンブロット、電気生理学的記録（パッチクランプまたは多電極アレイ）のための）7,15,18。 注：培養系はまた、培養物11の急性および慢性の薬理学的治療に適しています。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

共有媒体でそれらを維持しながら、現在のプロトコルの主な目標は、完全に独立した神経細胞とアストロサイトの培養物です。このため、得られた培養物の純度は、手順の開始時に確認されるべきです。私たちは、オリゴデンドロサイト前駆マーカーおよびミクログリアを識別するためにIBA1タンパク質としてO4抗原、アストロサイトのマーカーとしてGFAP、神経細胞のマーカーとして、ニュー...

過去数十年間を通して、神経膠細胞機能の一般的な解釈は、神経機能1についての積極的な規制の役割に向かって単に支持するの帰属から進化してきました。そのため、健康と病気2における脳の恒常性に対するその顕著な影響のため、アストロサイトは、科学界のために特別な関心があります。過去数年間において、研究の多様性は、in vivoおよびin vitro 3ニューロン-グリア相互作用に焦点を当てています。しかし、培養系のほとんどは、両方の細胞型のとそれぞれのsecretomesの独立した分析を可能にするものではありません。 いくつかのアプローチは、長期的な生存および生理学的に関連する神経回路網の開発4-6を達成するために、ニューロンとグリアの直接共存培養を利用します。物理的に分離された7両方の細胞型を維持しながら、本プロトコルは、同じ目標に到達します。 conditioneに比べてD媒体は、我々のシステムは、ニューロンとアストロサイト間の双方向通信を勉強することができ、8,9近づきます。細胞は、共有媒体に成熟さながら分泌シグナル伝達分子の発現をモニターすることができます。アストロサイトは、それによってニューロンの成長を調節する、例えば、サイトカイン、成長因子および細胞外マトリックス分子10,11として可溶性因子を放出し、7,12機能として、この機会は、特に関連性があります。したがって、 インビトロでの網膜神経節細胞のトロンボスポンジンの添加は、シナプス13の形成を誘導することが実証されています。しかし、他の未知の要因が13、機能的シナプスをレンダリングするために必要です。また、星状細胞により放出された分子は、ニューロン - グリア相互作用の基礎を理解するために識別されなければなりません。 マウスおよびラットからの一次ニューロンとアストロサイトの栽培は、以前に14から16に記載されています。ここで間接共培養法で両方の細胞型を結合するエレガントで汎用性の高いツールを提示します。二つの文化は、物理的に同じ媒体を共有まだ分離されているため、ニューロン、星状細胞および可溶性分子の影響は、別々に、したがって神経グリア相互作用研究のための強力なツールを作成し、分析することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:115px;">Reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">B27</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">17504-044</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">Cytosine-&#223;-D arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C1768</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317, H361</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DMEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">DNAse</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">LS002007</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">G1397</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317-334</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Glucose</td>
			<td style="width:152px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">22700</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HBSS</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">14170-088</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">15630-056</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Horse serum</td>
			<td style="width:152px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:151px;">S9135</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C-2529</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">MEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">31095-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A7641</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H334</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Papain</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">3126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">PBS</td>
			<td style="width:152px;">self-made&#160;</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0899</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P3655</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">S8636</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Equipment</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">24 well plates</td>
			<td style="width:152px;">Thermoscientific/Nunc</td>
			<td style="width:151px;">142475</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">24-wells plate (for the&#160; indirect co-culture)</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353504</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Binocular</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">MZ6</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Cell-culture inserts</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353095</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Counting Chamber</td>
			<td style="width:152px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:151px;">650010</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Forceps</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont (#5)</td>
			<td style="width:151px;">11254-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">glass cover slips (12 mm)</td>
			<td style="width:152px;">Carl Roth (Menzel- Gl&#228;ser)</td>
			<td style="width:151px;">P231.1</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Incubator</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Heracell 240i</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Micro tube (2 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">72,691</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">DMIL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Millex Syringe-driven filter unit</td>
			<td style="width:152px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:152px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Innova 4000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Parafilm</td>
			<td style="width:152px;">Bemis</td>
			<td style="width:151px;">PM-996</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Petri dishes (10 cm)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,902</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">pipette (1 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">Pipetman 1000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sterile work bench</td>
			<td style="width:152px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:151px;">Laminar Flow SterilGARD III</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:151px;">14094-11</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Syringe</td>
			<td style="width:152px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:151px;">9003016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">T75 flask</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,911,002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">tube (15 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">64,554,502</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Water bath</td>
			<td style="width:152px;">GFL</td>
			<td style="width:151px;">Water bath type 1004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

適切な神経細胞の発達と機能の開発と成人の脳の前提条件です。しかし、複雑な神経回路網の高度に制御形成と維持のメカニズムは完全にこれまで理解されていません。健康と病気のニューロンに関する未解決の問題は、人間の関連する病状、 例えば、アルツハイマー病や統合失調症を調査する基本的な開発を理解することから、多様で到達しています。ニューロンのほとんどの詳細な分析は、 インビトロで行うことができます。しかし、神経細胞は、細胞を要求し、その長期生存のためのアストロサイトの追加支援を必要としています。この細胞異質は、ニューロンとアストロサイトの分析を分析することを目的と矛盾しています。物理的でありながら、私たちは、ここで同じ化学的に規定された培地を共有する純粋な一次ニューロンとアストロサイトの長期的な共存培養を可能にする細胞培養アッセイを提示します分離しました。この設定では、培養物は、4週間まで生存し、アッセイは、ニューロン - グリア相互作用に関する研究の多様性に適しています。

間接的共培養システムを介して神経細胞培養物の分析は、多種多様であり、培養成熟の異なる段階で行うことができます。細胞は、最大4週間維持することができるという事実のために、培養物の長期的な研究が可能です。 図1の中央の左側のパネルで概略的には、共存培養のセットアップを示しています。星...

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The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

このプロトコルは、ニューロン - グリア相互作用の区画化分析のための間接的なニューロン、星状細胞共培養を説明します。

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K ビュー.  Ruhr-University. このプロトコルは、ニューロン - グリア相互作用の区画化分析のための間接的なニューロン、星状細胞共培養を説明します。 

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Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Observing Virtual Social Interactions

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language affect our decisions in personal and professional life alike 1. These "friend or foe" judgements are often based on first impressions, which in turn may affect our decisions to "approach or avoid". Previous studies investigating the neural correlates of social cognition tended to use static facial stimuli 2. Here, we illustrate an experimental design in which whole-body animated characters were used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) recordings. Fifteen participants were presented with short movie-clips of guest-host interactions in a business setting, while fMRI data were recorded; at the end of each movie, participants also provided ratings of the host behaviour. This design mimics more closely real-life situations, and hence may contribute to better understanding of the neural mechanisms of social interactions in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in social behaviour in such clinical conditions as social anxiety and autism 3.

This article demonstrates an experimental design in which whole-body animated characters are used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) to investigate the neural correlates of observing virtual social interactions.

仮想社会的相互作用を観察するの神経相関の脳イメージング研究

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language ...

神経科学

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

感情の記憶増強効果の脳イメージング研究

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

認知に関する情動の損なう効果の脳イメージング研究

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form during the earliest stages of brain development and are maintained throughout the animal's life. The brain ventricular system is found in vertebrates, and the ventricles develop after neural tube formation, when the central lumen fills with cerebrospinal fluid (CSF) 1,2. CSF is a protein rich fluid that is essential for normal brain development and function3-6.
In zebrafish, brain ventricle inflation begins at approximately 18 hr post fertilization (hpf), after the neural tube is closed. Multiple processes are associated with brain ventricle formation, including formation of a neuroepithelium, tight junction formation that regulates permeability and CSF production. We showed that the Na,K-ATPase is required for brain ventricle inflation, impacting all these processes 7,8, while claudin 5a is necessary for tight junction formation 9. Additionally, we showed that "relaxation" of the embryonic neuroepithelium, via inhibition of myosin, is associated with brain ventricle inflation.
To investigate the regulation of permeability during zebrafish brain ventricle inflation, we developed a ventricular dye retention assay. This method uses brain ventricle injection in a living zebrafish embryo, a technique previously developed in our lab10, to fluorescently label the cerebrospinal fluid. Embryos are then imaged over time as the fluorescent dye moves through the brain ventricles and neuroepithelium. The distance the dye front moves away from the basal (non-luminal) side of the neuroepithelium over time is quantified and is a measure of neuroepithelial permeability (Figure 1). We observe that dyes 70 kDa and smaller will move through the neuroepithelium and can be detected outside the embryonic zebrafish brain at 24 hpf (Figure 2).
This dye retention assay can be used to analyze neuroepithelial permeability in a variety of different genetic backgrounds, at different times during development, and after environmental perturbations. It may also be useful in examining pathological accumulation of CSF. Overall, this technique allows investigators to analyze the role and regulation of permeability during development and disease.

We describe a live whole animal quantitative measurement for permeability of the embryonic zebrafish brain. The technique analyzes the ability to retain cerebrospinal fluid and molecules of different molecular weights within the neural tube lumen and quantifies their movement out of the ventricles. This method is useful for determining differences in epithelial permeability and maturation during development and disease.

ゼブラフィッシュ胚性神経上皮の透水性に関するアッセイ

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

アン<em&gt;体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための&gt;モデル

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

体外タウ蛋白と創薬スクリーニングの集計を勉強するための試金

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...