This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. souches, de la Culture, et Microscopie <ol><li> Manipuler et à entretenir des souches de C. elegans comme décrit précédemment 19. Les souches sont disponibles sur le Centre de Génétique Caenorhabditis (CCG). NB: Les souches utilisées dans ces expériences étaient CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3-lacZ :: NGFP; Pmyo-3 :: Mtgfp) I; lui-8 (e1489 IV)) avec des protéines de fusion GFP localisées aux mitochondries et des noyaux; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) avec des protéines de fusion GFP localisée à l&#39;appareil contractile et PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); unc- 54 :: lacZ) V) avec β-galactosidase des protéines de fusion localisées dans le cytosol. </li><li> Expériences ARNi complet tel que décrit précédemment pour les expériences de RNAi plusieurs générations 13 et obtenir bactéries ARNi de la séquence vérifiées bibliothèque ORF-ARNi construit par Marc Vidal et al. 12. </li><li> Construire des souches contenant &lt;em&gt; CCIS 4251, jls01 ou CCI 55 en utilisant des techniques standard de 20. Utilisez ces transgènes pour créer une souche à évaluer la structure du réseau mitochondrial, l&#39;organisation de la myosine ou l&#39;état de protéostasie, respectivement. Centre des souches dans un mutant dans lequel la recherche à l&#39;un de ces compartiments sous-cellulaires dans chaque animal est souhaitée. </li><li> Utilisation de l&#39;inhibiteur PtdIns-3-kinase, LY-294002 (LY) comme 21 précédemment décrit. En bref, ajouter LY-294002 à une concentration finale de 160 uM au-dessus de plaques sèches de OP50 tête de série NGM. </li><li> Capturer les images en utilisant un filtre de GFP pour les expériences à base de GFP et un microscope avec un filtre passe triple qui permet l&#39;imagerie des canaux rouge, vert et bleu en même temps pour l&#39;évaluation in vivo du potentiel de membrane dans de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, communément commercialisé sous le MitoTracker Red CMXRos. Effectuer une analyse de l&#39;image et la préparation des figures dans le logiciel de traitement d&#39;image. </li></ol><ol><li> Un minimum de 1 jour avant nécessaire, faire tampon M9 - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, NaCl 85.56 (Les concentrations finales), et stériliser à l&#39;autoclave. Une fois refroidi à 45 ° C, ajouter stérile MgSO 4 à 1 mm après passage à l&#39;autoclave pour 22 empêcher la précipitation. Laisser refroidir le M9 à 4 ° C et aliquote dans des tubes de 50 ml. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, ajouter 3 ml de tampon M9 à une seule plaque de 9 cm avec un grand nombre de larves L1. Laver la plaque à plusieurs reprises par l&#39;aspiration du liquide M9 et pipetage contre la surface de l&#39;agar-agar avec la plaque maintenue à un angle. </li><li> Laver les L1 de de la plaque, puis transférer le M9 dans un tube à essai de 10 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Laisser pendant 2,5 minutes pour permettre à la plus grande des adultes et animaux au stade larvaire ultérieures de tomber au fond du tube à essai et les animaux de L1 plus petits restent près de la top de la mémoire tampon M9. </li><li> Retirez les 500 premières ul de M9 dans le tube à essai avec une pipette. Puis ajouter le M9 contenant des larves L1 à une nouvelle plaque NGM ensemencé avec 500 pi OP50 sous un microscope à dissection. </li><li> En règle générale, visant à transférer ~ 200-300 larves L1 par plaque. Surveiller les plaques quotidiennement à partir de l&#39;âge adulte et, si nécessaire, enlèvement des animaux sur des plaques NGM OP50 fraîches pour empêcher source de nourriture consommée OP50. Remarque: il est généralement de 1 à 3 gouttes de M9 à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000, bien que cela varie en grande partie en fonction du nombre de L1 de la plaque d&#39;origine. </li><li> Si des études prospectives sur des animaux individuels sont souhaitées, une fois les animaux atteignent l&#39;âge adulte, choisir des animaux individuels de séparer les plaques NGM graines. animaux de transfert chaque 24-48 h pour séparer des animaux larvaires. </li></ol> 3. Mouvement dosages 19 <ol><li> Un minimum de 2 heures avant le début de l&#39;expérimentation, retirez 50 ml aliquote de M9 et ramener à la température ambianterature. </li><li> Choisissez un animal adulte seul dans le tampon M9 de 50 pi sur une lame de microscope. </li><li> Comptez le nombre de courbes du corps gauche et vers la droite en 10 sec, où un à gauche et un coude vers la droite est égale à un accident vasculaire cérébral. </li><li> Répétez le nombre de coups de corps pour donner un total d&#39;au moins 5 mesures à partir de laquelle une moyenne peut être prise. Multipliez ces chiffres par six pour donner le taux de mouvement par minute. </li><li> Avec une pipette, transférer le dos de l&#39;animal à la boîte de Pétri. Cette méthode permet de mesurer le temps de mouvement tout au long de la durée de vie en C. elegan s. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1: tests de mouvement. Une fois que les vers sont pris en tampon, une vers la gauche (A) et une droite (B) courbure sont additionnées pour donner un mouvement complet(Accident vasculaire cérébral). 4. Imagerie de mitochondriales Réseaux et sarcomères dans le muscle du corps mur <ol><li> REMARQUE: Le même protocole applique pour l&#39;imagerie à la fois les mitochondries et sarcomères. </li><li> Synchroniser vers tel que décrit précédemment (section 1) et pousser pour 48-60 h à 20 ° C quand ils atteindront l&#39;âge adulte. </li><li> Choisissez 20 vers (représentatives de la plaque) des plaques dans 20 ul M9 sur une lame de microscope. </li><li> Appliquer une lamelle et procéder à l&#39;image en utilisant un microscope à fluorescence sous un filtre de la GFP (460-500 nm, bleu clair excitation) à un grossissement de 40X. </li></ol> 5. Évaluer le potentiel de membrane à l&#39;aide d&#39;une accumulation essai in vivo avec MitoTracker Rouge CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) <ol><li> Synchroniser CB5600 (Section 1), tous étiquetés avec la GFP dans les mitochondries des muscles, et de grandir à l&#39;âge adulte sur NGM contenant OP50 pour 48-60 h à 20 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul DMSO à l&#39;aliquote de 50 mg de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O pour obtenir une solution stock de 940,692 uM. </li><li> Prendre 1 pl de la solution mère de 940,692 uM et remettre en suspension dans 199 ul M9 pour créer une solution de travail de 4,70 uM (4,70346 pm). Préparer cette brune en tubes de 1,5 ml car C 32 H 32 Cl 2 N 2 O est photosensible. </li><li> Préparer aliquotes de 20 pi de 4,70 uM solution (20 vers adultes par 20 pi aliquote) de travail. </li><li> 20 Choix des animaux adultes dans 20 pl de 4,70 uM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O dans des tubes de 1,5 ml brun. Incuber à 20 ° C pendant 1 heure. </li><li> Après l&#39;incubation de 1 heure, ajouter 1 ml M9 pour les brunes tubes de 1,5 ml contenant les vers, centrifuger à 2000 g pendant 10 secondes, puis éliminer le surnageant. Répétez cette étape de lavage avant de remettre en suspension le culot de ver et de transférer les 20 restants μl (contenant les vers) à une diapositive pour l&#39;imagerie. </li><li> Prendre des images de la mitochondrie avec un grossissement de 40X en utilisant un filtre passe triple qui permet la visualisation à la fois des canaux rouge, bleu et vert simultanément. L&#39;imagerie en utilisant le filtre passe-montre triple co-localisation de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O avec GFP localisée aux mitochondries apparaissant comme orange. </li><li> Ayant pris une image de la mitochondrie orange, photo-blanchiment de l&#39;animal pendant 10 secondes en utilisant la lumière de longueur d&#39;onde 540/25 nm sur les réglages maximum avec tous les filtres retirés. Cela blanchir le rouge dans les mitochondries et de révéler la GFP mitochondrial seul à confirmer colocalisation dans les mitochondries musculaires. </li></ol> 6. Évaluation de la dégradation des protéines musculaires chez C. elegans <ol><li> Synchroniser PD55s (ou toute souche contenant le transgène LacZ) sur des plaques NGM ensemencé avec OP50 (Section 1). Grandir à l&#39;âge adulte pour 48-60 h à 20 ° C. </li><li> Choisissez 20 vers adultes dans 20 ul ddH 2 O sur une lame de microscope. Veillez à essayer et choisir seulement le ver et non les bactéries avec le choix. Étiqueter la lame de microscope au crayon. </li><li> Placez dans le dessiccateur pendant 30 min à sécher et craquer la cuticule des animaux. Assurer l&#39;étanchéité sur le dessiccateur avec de la graisse autour du joint. </li><li> Vérifiez la dessiccation a été efficace sous un microscope à dissection (figure 2). </li><li> Plonger la lame de microscope dans l&#39;acétone glacée pendant 3,5 min, puis quittent la lame de microscope sur une serviette en papier à la température ambiante pendant 15 minutes pour permettre à l&#39;acétone sur la diapositive à évaporer. A ce stade, dégeler le tampon de X-gal et de l&#39;oxydation et de permettre l&#39;équilibrage de la température ambiante. </li><li> Ajouter 2 pi X-gal à 100 pi de tampon d&#39;oxydation et vortex doucement pour assurer ce soit homogène. Ceci est le maître de tampon mélange X-gal / oxydation. </li><li> Ajouter 20 ul du maître de tampon mélange X-gal / oxydation de chaque ozone riginal de 20 vers. Inspectez sous un microscope à dissection pour assurer le mélange maître couvre complètement tous les animaux totalement. Inclinez doucement la lame de microscope pour déplacer le mélange maître sur les zones où les animaux ne sont pas couverts. </li><li> Placer la lame de microscope dans une chambre humide pendant 1 à 2,5 h à 20 ° C. animaux d&#39;image quand une couleur bleu foncé est présent dans les muscles de la paroi de corps d&#39;animaux de contrôle. Évaluer les animaux de contrôle sous un microscope à dissection toutes les 15 minutes afin de déterminer si les animaux doivent être imagés. </li></ol><img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> Figure 2: Evaluation de la dégradation des protéines musculaires en utilisant des essais β-galactosidase. (A) Les animaux contenant un transgène lacZ sont cueillis à partir des boîtes de Pétri de 20 ul trou DDH 2 O sur une lame de microscope (B). Les animaux sont desséchés et deviennent fracturé <strong&gt; (C). Les animaux sont ensuite lavées dans de l&#39;acétone (D). Une fois l&#39;acétone évapore le maître de tampon mélange X-gal / oxydation est ajouté (e). Le développement de la couleur bleue dans les animaux témoins est évaluée à des intervalles de 15 min (FL) à partir de t = 0 min (F) jusqu&#39;à ce qu&#39;une couleur bleu foncé est obtenue sur toute la longueur des animaux (L). Images de vers sont prises à 2,5x en AE et 8X en Floride. Zoom avant C, D, F, G et L sont 4X le grossissement d&#39;origine.

The authors have nothing to disclose.

Le muscle est un tissu multifonctionnel, très apprécié pour son rôle dans la locomotion, soutien postural et le métabolisme. Le développement et l&#39;entretien des muscles en bonne santé nécessite la coordination de plusieurs processus et de composants cellulaires. Soit par des dommages ou maladie, dérèglement peut se produire, entraînant dans la structure et / ou la fonction musculaire altérée. déclin lié à l&#39;âge dans la fonction musculaire présente une charge importante pour les budgets des soins de santé dans le monde occidental, depuis la masse musculaire 1,2 et en particulier de la force musculaire et l&#39;endurance 3-5 sont corrélés négativement avec la mortalité. La mesure des aspects liés à la détérioration de la fonction musculaire comme la fonction mitochondriale modifiée ou perturbation du sarcomère, peut permettre une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent les développement musculaire global et la santé. Elegans C aenorhabditis (C. elegans) est un microscopiques bes de nématodest connu parce qu&#39;il a été le premier organisme multicellulaire d&#39;avoir l&#39;ensemble de son génome a été séquencé 6, le premier à avoir des gènes au silence en utilisant l&#39;ARNi 7, et le seul à avoir des métazoaires toute sa lignée cellulaire 8 et 9 neuroanatomie déterminé. C. elegans a été proposée comme un modèle pour l&#39;étude du contrôle génétique du comportement en 1974 par Sydney Brenner 10 et l&#39;importance de ce travail et la suite a été reconnu avec la première des trois prix Nobel attribués à C. elegans chercheurs. Environ 35% des gènes de C. elegans ont identifié orthologues chez l&#39;homme, avec C. elegans est un organisme clé utilisée pour comprendre le contrôle génétique du développement musculaire 11. Presque chaque gène dans le génome de C. elegans peut être renversé par ARNi 7,12. Ainsi, en abattant des gènes dans le muscle pleinement développé, les composants génétiques contribuer à la remisegulation de la santé des muscles peut être étudiée avec simplicité relative 13. La capacité combinée d&#39;utiliser l&#39;ARNi, des mutants et des composés chimiques permet de C. elegans un système de choix pour explorer la régulation génétique 7,14,15 de la structure et de la fonction musculaire avec 16 ans et dans les modèles de la maladie 17. L&#39;impact de l&#39;effet de choc de gène, mutation et / ou l&#39;exposition à des composés chimiques sur la structure et / ou la fonction des muscles peut être mesurée par plusieurs aspects. Ici, nous décrivons brièvement des techniques simples pour l&#39;évaluation de C. elegans la structure musculaire et la fonction, dont beaucoup peuvent être utilisés dans des études prospectives de la santé des muscles. Le développement de la protéine fluorescente verte (GFP) 18 a permis la visualisation à la fois de la localisation de protéines spécifiques et la structure générale des organites chez C. elegans. Nous expliquons ici comment GFP exprimé spécifiquequement à l&#39;intérieur de corps mitochondries paroi musculaire, des noyaux ou des sarcomères peuvent être utilisés pour déterminer si la dystrophie de ces structures sous-cellulaires est présent. Comme la structure est pas toujours un substitut fiable pour fonction, nous expliquons aussi comment l&#39;évaluation du potentiel de membrane mitochondriale altérée dans le muscle de l&#39;utilisation de colorants cationiques in vivo permet. Quand les colorants sont utilisés en combinaison avec la GFP, ils permettent l&#39;étude de l&#39;architecture et le fonctionnement d&#39;une manière tout au long de la durée de vie temporelle. Enfin, nous expliquons aussi comment homéostasie protéique dans le muscle peut être évaluée et comment toutes ces mesures peuvent être utilisées pour établir une corrélation entre les changements dans l&#39;ensemble de la santé des muscles des animaux via l&#39;utilisation de tests de mouvement. Ces techniques, combinées avec knock-down de gènes, de mutations et / ou des composés chimiques fournissent un arsenal puissant pour étudier la façon dont les gènes ou les composés spécifiques influent sur ​​la santé de muscle in vivo. Les parallèles de la structure, le métabolisme et la fonction du muscle brut entre C. elegans etmammifères signifient C. elegans est un organisme modèle exceptionnel pour la compréhension de la régulation de muscle dans les organismes supérieurs, y compris les humains.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:195px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:187px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td style="width:187px;">Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">67-63-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">KH2 PO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:103px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">301584L</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgSO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7506</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Microscopy Slides</td>
			<td style="width:103px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">K220</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Microscopy Cover Slips</td>
			<td style="width:103px;">VW2 International</td>
			<td style="width:119px;">631-0124</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1.5ml Eppendorph Tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB74031</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Dessicator</td>
			<td style="width:103px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">D2672</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">H600L</td>
			<td style="width:187px;">Nikon H600L microscope with proprietary software</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Camera</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Fi1</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:195px;">Zeiss Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Ax10</td>
			<td style="width:187px;">Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Plates 9cm</td>
			<td style="width:103px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">82-1473</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:195px;">Plates 6cm</td>
			<td rowspan="2" style="width:103px;">Gosselin</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">BP53-01</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">Potassium Ferrocyanide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">14459-95-1&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:195px;">Na3PO4</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7601-54-9</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="147" rowspan="3" style="height:147px;width:195px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7240-90-6&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">N,N8-dimethylformamide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">68-12-2&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

Le muscle est un tissu dynamique qui répond aux changements dans la nutrition, l&#39;exercice et l&#39;état de la maladie. La perte de la masse musculaire et la fonction de la maladie et l&#39;âge sont les charges publiques importantes pour la santé. Nous comprenons actuellement peu de choses sur la régulation génétique de la santé des muscles de la maladie ou de l&#39;âge. Le nématode C. elegans est un modèle établi pour la compréhension de la régulation génomique des processus biologiques d&#39;intérêt. Les muscles de la paroi du corps de ce ver affichent un grand degré d&#39;homologie avec les muscles des espèces de métazoaires plus élevés. Etant donné que C. elegans est un organisme transparent, la localisation de la GFP à la mitochondrie et sarcomères permet la visualisation de ces structures in vivo. De même, l&#39;alimentation des animaux des colorants cationiques, qui accumulent basé sur l&#39;existence d&#39;un potentiel de membrane mitochondriale, permet l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale in vivo. Ces méthodes, ainsi que l&#39;évaluation de la protéine de muscle Homeostasis, sont combinées avec la fonction d&#39;évaluation de l&#39;ensemble des muscles des animaux, sous la forme de dosages de déplacement, afin de permettre la corrélation des défauts sous-cellulaires avec les mesures fonctionnelles de la performance musculaire. Ainsi, C. elegans fournit une puissante plate-forme permettant d&#39;évaluer l&#39;impact des mutations, knockdown de gènes, et / ou des composés chimiques sur la structure et la fonction musculaire. Enfin, comme la GFP, les colorants cationiques, et les analyses de mouvement sont évalués de manière non invasive, des études prospectives de la structure et de la fonction musculaire peuvent être menées sur l&#39;ensemble du cycle de vie et ce à l&#39;heure actuelle ne peuvent pas être facilement étudiés in vivo dans tout autre organisme.

Mouvement essais pour quantifier les défauts Mouvement déclin du mouvement est un bon prédicteur de la mortalité en C. elegans 16, avec des taux indiquant des problèmes avec le système neuromusculaire diminué. Changements dans le mouvement, comme évalué par des tests de mouvement, peuvent résulter de l&#39;ARNi contre un gène spécifique ou un traitement médicamenteux (figures 3-5) ou chez les animaux mutants 13, 23. Une baisse de mouvement peut résulter d&#39;un développement altéré par exemple suite à coup vers le bas du développement des gènes de transport d&#39;électrons codant complexe I, III, IV ou V 24. En outre, des interventions spécifiques peuvent être testés que sur des adultes de C. elegans pour étudier l&#39;effet sur ​​la physiologie post-développement. Par exemple, les animaux traités avec l&#39;ARNi contre unc-112, qui code pour le C. elegans orthologue de Kindlin-1 qui est localisée à l&#39;intégrine contenantcomplexes de fixation musculaire (figures 3 et 4), ou gaz-1, qui code pour un composant de complexe I de la chaîne de transport d&#39;électrons (Figure 4), affichent une diminution progressive de mouvement par rapport au contrôle de 48 à 72 heures après l&#39;âge adulte. Cela peut être le signe d&#39;un problème avec la physiologie des muscles. De même, une perte de mouvement 24 à 72 heures est observée en réponse au traitement d&#39;adultes normalement développés avec le traitement avec l&#39;inhibiteur de PI3K LY-294002 (Figure 5). Il est également possible de tester l&#39;effet d&#39;un second traitement d&#39;ARNi, d&#39;une mutation ou d&#39;un médicament dans le rétablissement de mouvement dans les animaux présentant réduit mouvement en réponse à une intervention initiale. Par exemple, les mutants 112 unc- présentent une réduction quantifiable en mouvement par rapport aux animaux de type sauvage qui est atténuée en présence d&#39;une seconde mutation dans une dim-13. Par conséquent, des tests de mouvement peuvent identifier les interventions qui modifient neuromuscudéveloppement de LAR et / ou de la fonction ainsi que ceux qui améliorent et / ou restaurer la fonction neuromusculaire. Évaluation des Sarcomère perturbation Après avoir identifié un défaut de circulation, il est souvent souhaitable de déterminer si la cause du défaut de circulation peut être expliqué par des problèmes dans les nerfs, les muscles, ou les deux. Sarcomères sont les complexes multi-protéines dans les muscles qui permettent la contraction et donc la génération de forces et de mouvements. En utilisant des animaux exprimant la myosine protéines de fusion GFP localisée à l&#39;appareil contractile, l&#39;ampleur de la perturbation de filaments de myosine et de sarcomères peut être observée relativement non invasive et de façon prospective dans des animaux individuels par le développement et / ou à l&#39;âge adulte. Animaux de type sauvage affichent sarcomères disposés en réseau qui apparaissent comme de multiples verts droites parallèles au sein de chaque muscle tégument (figure 3). Perturbation de ces tableaux normaux peut être relativement mineursarcomères disposés apparaissant à fusionner plutôt que de rester en parallèle. Ce phénotype, visible avec unc-112 ARNi à t = 24 h ou 48 h (Figure 3), est comparable à Z en ligne en streaming des sites de fixation de l&#39;actine dans le muscle des mammifères. De même, les petites parties des matrices peuvent réduire ou ils peuvent disparaître complètement comme un traitement avec unc-112 ARNi à t = 48 h ou t = 72 h (Figure 3). La présence de défauts de sarcomère dans le muscle des animaux qui présentent un défaut de mouvement (Figure 3) est suffisante pour expliquer le défaut de mouvement, mais ne règle pas nécessairement d&#39;autres problèmes avec le muscle, nerf, et / ou d&#39;autres tissus en réponse à une intervention . Évaluation de la structure mitochondriale réseau En présence d&#39;un défaut de mouvement, il est parfois souhaitable d&#39;examiner muscle pour les autres défauts qui peuvent causer ou contribuer au mouvement deparfaite. Les mitochondries fournissent l&#39;essentiel de l&#39;énergie cellulaire et diminue en mouvement peut être le résultat de la prestation ATP réduit, ce qui réduit l&#39;énergie disponible pour la contraction musculaire. Ainsi, la structure des mitochondries peut être examinée pour les anomalies. Il est important de ne pas anesthésier les animaux avec de l&#39;azoture de sodium comme il induit la fragmentation mitochondriale rapide; dans ces expériences, les animaux ont été immobilisées par la pression appliquée par la lamelle couvre-objet. Dans de type sauvage de C. elegans corps paroi musculaire, les mitochondries sont contenues dans des réseaux organisés (Figure 4) et les mitochondries exister et de fonctionner comme un réticulum 25. Perturbation du réseau des mitochondries présente comme la fragmentation du réseau (gaz-1 ARNi, figure 4B) 26. La fragmentation peut devenir suffisamment grave qu&#39;aucun semblant de réseaux organisés reste comme un traitement avec unc-112 ARNi (figure 4B et C) 13. Comme wie perturbations dans la structure du sarcomère, des défauts dans la structure musculaire mitochondriale chez les animaux qui présentent un défaut de mouvement peuvent être suffisants pour expliquer le défaut de mouvement, mais cela ne règle pas nécessairement d&#39;autres problèmes avec les muscles, les nerfs, et / ou d&#39;autres tissus. Par exemple, UNC 112 mutants 13 et traitement à l&#39;UNC-112 ARNi (figures 3 et 4) affichage deux sarcomères perturbé et perturbé la structure mitochondriale. Évaluation de la fonction mitochondriale in vivo Le potentiel de la membrane mitochondriale détermine la capacité des mitochondries pour créer une force motrice protonique et de générer de l&#39;ATP 27, donc la possibilité d&#39;évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale in vivo indique que la capacité de l&#39;animal à produire de l&#39;ATP. Comme perturbations structurelles mitochondriales peuvent ou ne peuvent pas modifier la capacité fonctionnelle des mitochondries, il peut être desirable pour évaluer la fonction mitochondriale chez les animaux présentant la structure mitochondriale modifiée. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O accumule dans les mitochondries, de tous les types de cellules, où un potentiel de la membrane est présent et colore les mitochondries 28 (figure 4C). Pour évaluer plus précisément la fonction mitochondriale dans le muscle, on peut utiliser C 32 H 32 Cl 2 N 2 O et GFP étiqueté mitochondries à démontrer les effets d&#39;une intervention spécifique sur mitochondries (figure 4C). Par exemple, la perte du potentiel de membrane mitochondriale traitement suivant avec unc-112 empêche l&#39;ARNi C 32 H 32 Cl 2 N 2 O de pénétrer dans la matrice. Les mitochondries montrent donc peu ou pas de coloration rouge de la mitochondrie, en plus du marquage des mitochondries de la GFP (Figure 4C). Photo-blanchiment peut également être utilisé pour confirmer que le observéles mitochondries sont ceux spécifiquement dans le muscle (figure 4C). Identification d&#39;une réduction de la capacité à produire de l&#39;ATP est suffisant pour rendre compte d&#39;un défaut de mouvement observé mais ne préjuge pas d&#39;autres problèmes dans les muscles, les nerfs, et / ou d&#39;autres tissus. Indépendamment, de la réduction des capacités de production de l&#39;ATP est associée à des états pathologiques chez l&#39;homme 29 et vieillissement 30, l&#39;identification d&#39;un tel défaut de réponse à une intervention fournit une plate-forme pour le criblage de composés et / ou des traitements ARNi qui améliorent la capacité de production d&#39;ATP et ceux-ci peuvent alors être davantage explorées pour un potentiel thérapeutique. L&#39;évaluation de la dégradation des protéines En présence d&#39;un défaut de mouvement et sarcomères et des mitochondries normales, il est parfois souhaitable d&#39;examiner muscle pour les autres défauts qui peuvent causer ou contribuer au défaut de mouvement. La capacité de maintenir l&#39;homéostasie protéique est une signature de nisanté mal, alors qu&#39;une réduction de la synthèse des protéines et / ou une augmentation de la dégradation des protéines est une conséquence du vieillissement 31 et de multiples états pathologiques 32,33. Par conséquent, il peut être souhaitable d&#39;examiner muscles des animaux avec un défaut de déplacement de l&#39;homéostasie de la protéine modifiée. Ceci peut être réalisé par l&#39;intermédiaire de l&#39;évaluation des niveaux de protéines musculaires cytosoliques. L&#39;utilisation de protéines codées par voie transgénique évaluation de muscle spécifique permet protéostasie. Par exemple, l&#39;utilisation des animaux contenant des β-galactosidase, fusionné à une portion N-terminale de la myosine, qui est synthétisée sous le contrôle d&#39;un promoteur de la myosine et l&#39;amplificateur évaluation de muscle cytosolique teneur en protéine de 19 le permet. La présence de taches bleu chez les adultes de type sauvage démontre la présence de β-galactosidase active et l&#39;absence de dégradation pathologique de la protéine cytosolique. Une perte de coloration en réponse à un traitement suggère la dégradation des protéines se produit pathologique (Figure 5 </strong&gt;), Comme β-galactosidase est stable pendant 72 à 96 heures après l&#39;âge adulte dans de type sauvage adultes 13,14,19. Par exemple, non traités les animaux de type sauvage montrent une intense coloration bleue 72 ​​heures après l&#39;âge adulte, alors que LY-249002 animaux traités présentent un manque de tache (Figure 5). Comme des défauts dans la structure du sarcomère et la fonction mitochondriale, la présence de pathologique dégradation des protéines musculaires est suffisante pour prendre en compte un défaut de mouvement observé mais ne règle pas nécessairement d&#39;autres problèmes avec les muscles, les nerfs, et / ou d&#39;autres tissus. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3: (A) unc-112 RNAi provoque un défaut de mouvement significatif à t = 72 h (B) l&#39;évaluation de la structure vêtu A-bande dans la paroi du corps musculaire.. Dans wt, A-bandes dans le muscle apparaissent en lignes droites à l&#39;âge adulte (t = 0 h) et restent en grande partie uniforme jusqu&#39;à au-delà de 72 heures de l&#39;âge adulte (voir zoom en poids). unc-112 RNAi provoque les sarcomères à perdre l&#39;architecture dans de petites zones de le muscle (t = 24 h), effondré et sarcomères manquantes (t = 48 h), l&#39;agrégation (panneau supérieur t = 72 h et zoom) et la perte de la linéarité de sarcomères (panneau inférieur t = 72 h et zoom). Barres d&#39;échelle représentent 25 pm et zooms sont 2.5X. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4: (A) unc-112 ou gaz-1 RNAi provoque un défaut de mouvement (B) l&#39;évaluation de la structure mitochondriale dans la paroi du corps musculaire.. Les mitochondries dans le muscle semble lignes droites comme en réseau à l&#39;âge adulte (poids). Traitement des animaux avec unc-112 RNAi entraîne mitochondrfragmentation ial comme précédemment observée entre 24 h et 72 h de l&#39;âge adulte (zooms et flèche) 13. De même, l&#39;ARNi contre gaz -1 résultats dans la fragmentation des réseaux mitochondriaux comme précédemment observé 26. Ils sont présents sous forme de petites lacunes dans le réseau mitochondrial à t = 24 h et le progrès de la désorganisation généralisée à 72 h (voir zoom et flèche). (C) Évaluation du potentiel de membrane mitochondriale in vivo. Chez les animaux contenant également GFP localisée à la mitochondrie, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O accumule dans les mitochondries des muscles de la paroi du corps et apparaît en orange sous un filtre passe triple de l&#39;âge adulte (t = 0 h) jusqu&#39;à 72 heures après l&#39;âge adulte. Le traitement par unc-112 RNAi entraîne une perte progressive du potentiel de membrane comme indiqué à 72 heures où les mitochondries restantes montrent moins d&#39;accumulation de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O vs poids. Photobleaching pour 10 SEc à l&#39;aide des agents de blanchiment 540/25 nm de lumière rouge de la MitoTracker et révèle la GFP localisée à mitochondries (+ de blanchiment photo). Barres d&#39;échelle représentent 25 um et zoome sont 2.5X. <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> Figure 5: (a) le traitement avec LY-294002 animaux induit un défaut de mouvement (B) l&#39;évaluation de la dégradation des protéines en utilisant un test β-galactosidase.. Âge synchronisée poids larves L1 sont cultivées à l&#39;âge adulte à 20 ° C (t = 0 h) avant le transfert à NGM ensemencé avec OP50 (contrôle de poids) ou NGM ensemencé avec LY-294002 (traitement inhibiteur de PI3K) pendant 24 heures à 20 ° C . En A, environ 20-30 animaux sont colorés pour l&#39;activité β-galactosidase (bleu) à t = 0 h et après 24 h, 48 h et 72 h.

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Méthodes pour évaluer les compartiments subcellulaires du muscle chez C. elegans | Biologie | Vidéo

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Le muscle squelettique est essentiel pour la locomotion et est le principal magasin de protéine de corps. mesures de santé musculaire dans C. elegans sont décrits. Changements éventuels à la structure et la fonction musculaire sont évalués à l&#39;aide GFP localisée et colorants cationiques.

Méthodes d&#39;évaluation de Subcellular compartiments de muscle en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

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16.5K vues.  University of Nottingham.  Le muscle squelettique est essentiel pour la locomotion et est le principal magasin de protéine de corps. mesures de santé musculaire dans C. elegans sont décrits. Changements éventuels à la structure et la fonction musculaire sont évalués à l'aide GFP localisée et colorants cationiques. 

Vidéo: Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

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Biologie

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Création d&#39;environnements gazeux définies pour étudier les effets de l&#39;hypoxie sur la<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Méthodes pour Blessant Peau et Essais pour les réponses de blessure dans<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...