Les auteurs tiennent à remercier le Dr Alistair Garratt (Centre Max Delbrück, Berlin) pour leurs précieux commentaires. Ce travail a été soutenu par le Centre de recherche en collaboration (SFB665) du Conseil allemand de la recherche (DFG).

1. Procédure de dissection Remarque: l&#39;utilisation expérimentale de la souris doit suivre des directives officiellement approuvées pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. <ol><li> Avant la préparation, mettre en place votre loupe binoculaire et à exposer les instruments chirurgicaux nécessaires à la dissection, y compris les ciseaux, grandes et petites, grandes pinces à griffes, pinces courbes et quatre séries de Dumont No.5 dissection pince (dont deux ont à l&#39;intérieur poli astuces) ( pour plus de détails voir le tableau des réactifs spécifiques et les équipements). Placez une feuille de papier filtre dans un 100 mm Sylgard enduits boîte de Pétri. Verser PBS froid dans le puits d&#39;une plaque de 12 puits, un plat de Pétri de 100 mm et un tube de 12 ml et laisser sur la glace. Pipeter 2 ml de tampon de fixation (paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pH 7,4) dans chaque puits d&#39;une seconde plaque de 12 puits et la placer sur la glace. </li><li> Après l&#39;anesthésie, le sacrifice du barrage chronométré enceinte à E12.5 (détection de bouchon vaginal a été désigné comme E 0,5), placez la sourisavec sa place face ventrale sur trois feuilles de papier absorbant et les faire tremper la région abdominale avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Ouvrez la cavité abdomino-pelvienne, d&#39;isoler les cornes utérines bilatérales et les transférer dans l&#39;un des plats de 100 mm avec PBS glacé. </li><li> Sous contrôle microscopique, faire une incision longitudinale de la paroi utérine avec de petits ciseaux droits et couper chaque sac amniotique du placenta. </li><li> Peler le sac amniotique de chaque embryon et couper le cordon ombilical. </li><li> L&#39;utilisation de petits ciseaux, décapitent les embryons et de mettre les têtes ou une partie d&#39;entre eux de côté pour l&#39;isolement de l&#39;ADN génomique, si génotypage devrait être requise. Par la suite, le transfert de l&#39;Torsi aux puits respectifs de la plaque de 12 puits avec du PBS froid. </li><li> Mouiller le papier filtre dans le plat Sylgard avec quelques gouttes de PBS et la position un torse embryonnaires avec sa face dorsale sur le papier. Pour une meilleure stabilité, redresser sa queue et les extrémités du corps. </li><li> De travailsous un microscope à dissection avec un grossissement d&#39;environ 16x, soigneusement pincer la peau de l&#39;embryon au-dessus de la moelle épinière avec deux paires de pinces fines pointes et doucement la déchirer. À partir du milieu, procéder d&#39;abord vers la queue et ensuite reprendre à partir du milieu vers le côté antérieur. </li><li> Mouiller l&#39;embryon de temps en temps avec deux ou trois gouttes de PBS pour l&#39;empêcher de sécher. </li><li> Pour éviter que les DRG sont déchiré hors de la moelle épinière où il est retiré de l&#39;embryon détacher le DRG et la moelle épinière de la colonne vertébrale cartilagineuse entourant par des mouvements horizontaux coulissants avec la lame d&#39;un pince fine avec à l&#39;intérieur poli conseils. A partir du milieu du côté droit de l&#39;embryon, de travailler votre chemin vers la queue et ensuite à l&#39;extrémité antérieure. Ensuite, répétez la procédure de l&#39;autre côté. Attention à ne pas déchirer la DRG associés. </li><li> Pour détacher complètement desserré le cordon médullaire de l&#39;embryon, ramasser ses cervicpartie avec une pince fine al et le sortir en un seul morceau vers son extrémité caudale. </li><li> Immerger le cordon épinière isolée avec des DRG attachés dans un puits de la plaque de 12 puits rempli de tampon de fixation et de procéder à la préparation de la moelle épinière à partir des embryons restants. </li><li> Fixer la moelle épinière au moins deux heures sur la glace. </li></ol> 2. DII-étiquetage des neurones DRG <ol><li> Pour chaque moelle épinière pour être étiqueté, préparer deux aiguilles de verre avec un extracteur micropipette. Nous utilisons un modèle Sutter extracteur P-97 de l&#39;électrode (réglage du programme: 1 CHALEUR = 625, Vel = 35, HEURE = 175; chaleur 2 = 600, Vel = 25, HEURE = 175; 3 CHALEUR = 630, Vel =... 30, HEURE = 150). </li><li> Sous contrôle microscopique trempe le bout de chaque aiguille de verre trois à cinq fois dans un 5% (p / v) solution de DiI dans l&#39;éthanol. L&#39;évaporation de l&#39;éthanol crée une fine couche de cristaux DiI sur l&#39;aiguille. </li><li> Travaillant sous une loupe binoculaire avec un grossissement d&#39;environ 40x, placez une moelle épinière avec ses ventral côté sur une diapositive. Avec des ciseaux à ressort, ouvrez le cordon sur la face ventrale à sa longueur en coupant à travers la plaque de sol pour permettre le montage ultérieur de la préparation dans un livre ouvert inversé mode (voir section C). </li><li> Position de la moelle épinière à la face dorsale sur une diapositive. Ensuite manuellement l&#39;approche du cordon avec la pointe de la DII-couverte de l&#39;aiguille de verre sous visualisation microscopique et soigneusement tous les DRG Pierce secondes sur un côté de la moelle épinière. Presque pas de traces de DiI devrait être visible dans le DRG percé pour assurer l&#39;étiquetage de seulement un petit nombre de neurones. Prenez une seconde aiguille pour l&#39;autre côté de la corde. Visant seulement chaque DRG seconde évite un chevauchement des projections axonales des étiquetés DRG voisins qui pourraient compliquer la différenciation des axones individuels. </li><li> Retour de la moelle épinière à la mémoire tampon de fixation et incuber dans l&#39;obscurité pendant au moins six heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C pour donner du temps pour que le colorant diffuse long de l&#39;axone au sein de la membrane plasmique. Prévoir une période d&#39;incubation plus longue (jusqu&#39;à deux jours à 4 ° C) si l&#39;analyse de la croissance des garanties dans la moelle épinière est souhaitée. </li></ol> 3. Analyse de montage et microscopique <ol><li> Après la diffusion, la position de teinture un seul cordon médullaire avec sa face dorsale vers le bas sur une lamelle dans une goutte de PBS. Prenez soin que le DRG attachés sont correctement orientés latéralement et ne se mêlent. Aspirer l&#39;excès de liquide et aplatir le cordon à l&#39;envers à livre ouvert mode en utilisant une pince. </li><li> Monter la préparation sur une lame de microscope à l&#39;aide de PBS. </li><li> Pour éviter l&#39;augmentation de la coloration de fond indésirable analyse par fluorescence microscopique des projections axonales étiqueté doit être effectué le jour du montage. Jusque-là garder les lames dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: La moelle épinière de la souris reçoit afférentes projections de 8 paires de cervicales, 13 paires de thoraciques, 5 paires de paires lombaires et 4 de la DRG sacrée totalisant à 60 ganglions spinaux. Après une formation une moelle épinière avec la plupart des DRG encore attaché peut être isolé à partir d&#39;un embryon dans moins de cinq minutes. Cette procédure est adaptée pour l&#39;isolement de la moelle épinière avec des DRG jointe de E11.5 E13.5 d&#39;embryons de souris. Cependant, les meilleurs résultats sont obtenus à partir E12.5. Des exemples de résultats de la procédure de labellisation décrites ici sont présentés dans la figure 3. L&#39;étiquetage des DRG sur toute la longueur de la moelle épinière peuvent alors être utilisés pour quantifier le comportement de branchement axonal à différents niveaux vertébraux (Fig. 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma illustrant les deux principaux modes de branchement axonal. (A) Branchement par les activités du cône de croissance qui pourrait conduire à une bifurcation - comme indiqué ci - ainsi que tonnelles terminaux complexes ouFormation de vaisseaux collatéraux (B) à l&#39;arbre axone (interstitiels de branchement). Le dernier mode est le type dominant de branchement des axones projetant corticales et thalamo 6,7. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> Figure 2 projections afférentes des neurones DRG dans la moelle épinière embryonnaire d&#39;affichage des deux types de branchement axonal:. Axones première succursale à l&#39;DREZ par bifurcation (1) et de la fille des branches forme résultant collatéraux après une période d&#39;attente par interstitielles de branchement (2). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> Figure 3. Visualisation des trajectoires simples axonales des neurones DRG embryonnaire de la souris. (A) de la moelle épinière avec des DRG attachés préparés à partir d&#39;un embryon de souris E12.5. (Barre d&#39;échelle, de 1 mm.) (BD) vues dorsale de DII-étiquetés DRG de souris de type sauvage à un grossissement de plus en plus sont affichés. Dans tous les B DRG deuxième labelej en DII. Images de fluorescence sont inversées, caudale est à gauche et en C et D, latéral est à la base. En C, un petit nombre d&#39;axones est étiqueté et un plus fort grossissement de la présence de T-comme les branches peuvent être identifiées dans le DREZ de la moelle épinière. (Barres d&#39;échelle, 250 um (B), 100 um (C) et 50 microns (D).) <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> Figure 4. Quantification des branches en forme de T, unique tourne rostrale ou caudale de type sauvage et le C-peptide natriurétique de type (CNP) des souris déficientes à E13.5. Le nombre d&#39;axones seule compté sont indiquées entre parenthèses pour des niveaux différents du tronc de chaque génotype. C-ou R-tours - la croissance seulement en direction caudale ou rostrale, respectivement. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> Figure 5. Un GMPc déclenche la signalisation de bifurcation axonale sensorielle à la DREZ de la moelle épinière. (A) Schéma dela voie de signalisation GMPc composé du ligand, le récepteur CNP guanylyl cyclase Npr2 et la sérine / thréonine kinase cGKIα dans les neurones DRG embryonnaire. Npr2 génère cGMP du GTP lors de la stimulation par la CNP. (B) DiI traçage des axones des neurones DRG unique chez les souris de type sauvage et CNP-déficients. (Barre d&#39;échelle, 25 pm).

<ol>
	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Schémas stéréotypés de projection comprenant deux types de formation branche axonale en collaboration avec la facilité de préparation en combinaison avec l&#39;utilisation de tissus fixés pour l&#39;étiquetage DiI rend le cordon embryonnaire épinière avec un modèle fixé DRG favorables pour étudier axonale branchement. L&#39;application de quantités infimes de DiI utilisant des aiguilles de verre enduit permet - contrairement à la majeure partie de l&#39;étiquetage DRG - la visualisation des petits groupes de neurones DRG et donc l&#39;analyse des axones individuels et leur ramification. La méthode décrite pourrait être encore améliorée par injection iontophorétique du traceur lipophile qui diminue encore le nombre de neurones marqués 8. Cependant, ce serait plus de temps. L&#39;étiquetage des DiI seule trajectoires axonales dans les préparations de montage de la moelle épinière embryonnaire a contribué à l&#39;identification d&#39;une cascade de signalisation GMPc-comprenant le ligand CNP, son récepteur Npr2, et lekinase GMPc-dépendante cGKIα - qui réglemente un type de branchement axonal: la bifurcation de neurones DRG au DREZ 4,5,9-12. Contrairement à la sauvage, les axones des neurones DRG de GMPc mutants de signalisation tournez dans une seule direction, au lieu de bifurquer à l&#39;DREZ (fig. 5). Ces études ont également révélé que la formation de garantie n&#39;a pas été affectée dans le GMPc mutants de signalisation indiquant que ce deuxième type de formation branche observés dans les neurones DRG est différemment réglementés 4. Sinon, le comportement de branchement des axones DRG unique peut également être étudié dans des lignées de souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente soit dans seulement un petit groupe de neurones DRG 13 ou contenant une combinaison de marqueurs fluorescents, qui permet de distinguer entre les neurones individuels 14. Toutefois, l&#39;effort pour croiser le modèle de souris mutantes pour être analysés avec les lignées de souris fluorescente doit être considéré. Par ailleurs, en raison de l&#39;promoteur (Thy1) expression utilisée sur les protéines fluorescentes dans les lignées de souris transgéniques commence seulement à des stades postnataux qui rend difficile de savoir si un phénotype observé de branchement est le résultat de la formation de la branche altérée pendant le développement embryonnaire ou une dégénérescence tard processus de la place. En revanche, Dii étiquetage des embryons DRG a l&#39;avantage d&#39;étudier le processus de branchement axonal et ses perturbations dans des mutants de souris approprié au moment où survient branchement axonal. Préparations de la moelle épinière embryonnaire avec des DRG attachée pourrait encore être utilisé pour d&#39;autres procédures d&#39;étiquetage (mount toute hybridation in situ, LacZ ou AP-coloration de souris transgéniques), collection de la moelle épinière et des tissus DRG pour l&#39;ARN-isolement, ou lorsqu&#39;elles sont adaptées aux conditions stériles pour des expériences de culture de tissus et d&#39;applications en aval, comme l&#39;imagerie calcique ou des mesures électrophysiologiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope Stemi RDC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solution tampon phosphate (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L 182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standard ciseaux chirurgicaux </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Crantée pince standards </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra fine ciseaux à iris </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pince courbée </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 fines pinces à pointes </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 finition miroir pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-Tübingen ciseaux à ressort </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Le papier filtre </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Instruments indéterminations mondiale </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mm boîtes de Pétri </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> Tube en polypropylène de 12 ml </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Plaque de culture à 12 puits </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipette extracteur P-97 </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Verre borosilicate capillaires </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-dioctadécyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tétraméthyl - indocarbocyanine perchlorate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Lames SuperFrost plus </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles de verre </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

Nous présentons ici une technique d&#39;étiqueter les trajectoires des petits groupes de neurones DRG dans la moelle épinière embryonnaire par coloration diffusif en utilisant les traceurs lipophiles 1,1 &#39;-dioctadécyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DII) 1 . La comparaison des voies axonales de type sauvage avec ceux des lignées de souris dont les gènes sont mutés permet de tester un rôle fonctionnel des protéines candidates dans le contrôle des axones de branchement qui est un mécanisme essentiel dans le câblage du système nerveux. Axonale branchement permet un neurone individuel de se connecter avec des cibles multiples, fournissant ainsi la base physique pour le traitement parallèle des informations. Ramifications au niveau des régions objectif intermédiaire de croissance axonale peut être distinguée de l&#39;arborisation terminale. Par ailleurs, différents modes de formation de la branche axonale peuvent être classés selon que les résultats de branchement des activités du cône de croissance (splitting ou soutien-gorge retardéenching) ou à partir du bourgeonnement de collatérales de l&#39;arbre axone dans un processus appelé interstitielle branchement 2 (fig. 1). Les projections centrales des neurones du DRG offrir un système expérimental utile pour étudier les deux types de branchement axonal: quand leurs axones afférents atteignent la zone de la racine dorsale d&#39;entrée (DREZ) de la moelle épinière entre jours embryonnaires 10 à 13 (E10 - E13), ils afficher un motif stéréotypé de T ou en forme de Y bifurcation. Les deux filles résultant axones ensuite dans des directions rostrale ou caudale, respectivement, à la marge du cordon dorsolatéral et seulement après une période d&#39;attente collatéraux poussent à partir de ces axones souches pour pénétrer la matière grise (interstitiels de branchement) et projet de neurones relais spécifiques lames de la moelle épinière, où ils ont en outre s&#39;arborisent (borne de branchement) 3. Tracés DiI ont révélé des cônes de croissance dans la zone d&#39;entrée des racines dorsales de la moelle épinière qui semblait être dans le processus de fractionnement ce qui suggère que la bifurcation est causée par fractionnement du cône de croissance lui-même 4 (Fig. 2), toutefois, d&#39;autres options ont été discutées ainsi 5. Cette vidéo montre d&#39;abord comment disséquer la moelle épinière des souris E12.5 laissant le DRG-joint. Suite à la fixation des montants du spécimen minuscule DiI sont appliqués à l&#39;aide d&#39;aiguilles de verre DRG tirée de tubes capillaires. Après une étape d&#39;incubation, le cordon médullaire étiquetés est monté comme un livre ouvert inversé la préparation d&#39;analyser les axones individuels en utilisant la microscopie à fluorescence.

Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Les projections stéréotypée des afférences sensorielles dans la moelle épinière des rongeurs offrent un système facilement accessible à l&#39;étude expérimentale de branchement axonal par le traçage d&#39;axones unique.

DII-étiquetage des neurones DRG pour l&#39;étude de branchement axonal dans une préparation Mont entiers de souris embryonnaires de la moelle épinière

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.8K vues.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine. Les projections stéréotypée des afférences sensorielles dans la moelle épinière des rongeurs offrent un système facilement accessible à l'étude expérimentale de branchement axonal par le traçage d'axones unique.

Vidéo: DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Préparation Mont entiers de l&#39;Adulte Drosophile Chaîne nerveuse ventrale pour injection fibre Dye Géant

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Préparation de cultures mixtes gliales primaires de souris adultes Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

DII-étiquetage des neurones DRG pour l'étude de branchement axonal dans une préparation Mont entiers de souris embryonnaires de la moelle épinière

Résumé

Explorer plus de vidéos

Chapitres dans cette vidéo

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

Préparation Mont entiers de l'Adulte Drosophile Chaîne nerveuse ventrale pour injection fibre Dye Géant

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le

Une

Préparation de cultures mixtes gliales primaires de souris adultes Spinal Cord Tissue

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes

poisson zèbre

Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans

Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris