Méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigment dans les photorécepteurs de la drosophile

Nous présentons un protocole pour caractériser électrophysiologiquement les photopigments bi-stables : (i) exploiter les déplacements de charge au sein des molécules de photopigment suite à l’absorption des photons et leur énorme quantité dans les photorécepteurs, et (ii) exploiter les différences de spectres d’absorption des états photopigment rhodopsine et métarhodopsine. Ces protocoles sont utiles pour dépister les mutations affectant les systèmes de photopigments stables.

La rhodopsine (R) couplée à la photopigment G-protéine de la drosophile est composée d’une protéine (opsine) et d’un chromophore. Le processus d’activation de la rhodopsine est initié par l’isomérisation du chromophore induisant l’absorption des photons, favorisant les changements conformationnels de l’opsine et entraînant un deuxième état photopigment stable et sombre (métarhodopsine, M). L’étude de ce photopigment bi-stable utilisant la mutagénèse aléatoire nécessite des méthodes simples et robustes pour le dépistage des mouches mutantes. Par conséquent, plusieurs méthodes de mesure des réductions des niveaux de photopigment fonctionnel ont été conçues. L’une de ces méthodes exploite les déplacements de charge dans le photopigment après l’absorption des photons et les énormes quantités de molécules de photopigment exprimées dans les photorécepteurs. Ce signal électrique, appelé potentiel récepteur précoce (ou courant récepteur précoce), est mesuré par diverses méthodes électrophysiologiques (par exemple, électrorétinogramme et enregistrements de cellules entières) et est linéairement proportionnel aux niveaux de photopigment fonctionnels. Les avantages de cette méthode sont le rapport signal/bruit élevé, la mesure linéaire directe des niveaux de photopigment et l’indépendance des mécanismes de phototransduction en aval de l’activation de la rhodopsine ou de la métarhodopsine. Une méthode électrophysiologique supplémentaire appelée postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite la bi-stabilité du photopigment de la drosophile et les différences spectrales d’absorption des états pigmentaires R et M des mouches. Le PDA est induit par une lumière bleue intense, convertissant des quantités saturées de rhodopsine en métarhodopsine, ce qui entraîne l’échec de la terminaison de la réponse lumineuse pendant une période prolongée dans l’obscurité, mais il peut être terminé par la conversion de la métarhodopsine en rhodopsine en utilisant une lumière orange intense. Étant donné que le PDA est un signal robuste qui nécessite une conversion massive du photopigment, même de petits défauts dans la biogenèse du photopigment conduisent à un PDA anormal facilement détecté. En effet, des mutants PDA défectueux ont conduit à l’identification de nouvelles protéines de signalisation importantes pour la phototransduction.

La rhodopsine (R) activée par la lumière, qui est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG), est composée d’une protéine transmembranaire 7 (opsine) et d’un chromophore. Chez Drosophila melanogaster (mouche des fruits), l’absorption des photons induit l’isomérisation du chromophore rétinien 11-cis-3-OH en tout-trans-3-OH-rétinien¹, favorisant le changement conformationnel de la rhodopsine en métarhodopsine (M, Figure 1A). Contrairement à la rhodopsine vertébrée, la fraction prédominante du chromophore invertébré ne se dissocie pas de l’opsine, ce qui entraîne l’état pigmentaire physiologiquement actif et stable à l’obscurité M. À son tour, l’absorption supplémentaire de photons par le chromophore rétinien entièrement trans-3-OH induit l’isomérisation du chromophore ^2,3, générant l’état pigmentaire R avec le chromophore rétinien 11-cis-3-OH. L’état R est un photopigment sombre, stable et physiologiquement non actif. En plus de la voie de régénération des photons extrêmement rapide du chromophore⁴, un peu comme les photopigments des vertébrés, il existe une voie lente enzymatique alternative pour la régénération des chromophores chez les invertébrés, dans laquelle certaines des étapes sont effectuées dans les cellules rétiniennes entourant les cellules photoréceptrices ^5,6.

La drosophile présente de grands avantages en tant qu’organisme modèle pour l’étude des photorécepteurs d’invertébrés. En particulier, l’accessibilité de la préparation et la capacité d’appliquer la génétique moléculaire ont fait de la drosophile un puissant système modèle⁷. Par conséquent, plusieurs méthodes expérimentales in vivo et ex vivo pour étudier la phototransduction en général et les niveaux de photopigment, en particulier, ont été établies. La méthode in vivo la plus simple exploite la réponse de tension extracellulaire relativement grande enregistrée à la lumière de l’œil de la drosophile. En conséquence, la stimulation lumineuse évoque une réponse de tension électrique dans l’ensemble de l’œil qui peut être mesurée à l’aide de l’enregistrement extracellulaire par électrorétinogramme (ERG), qui est ~ 3 ordres de grandeur plus grand que la réponse ERG à la lumière des yeux vertébrés ^8,9. La réponse ERG de la drosophile est robuste et facile à obtenir, ce qui en fait une méthode pratique pour identifier les anomalies de la réponse à la lumière dues aux mutations. La réponse ERG à la lumière provient principalement des photorécepteurs, des cellules pigmentaires (glie) et des neurones secondaires de la lame (voir la figure 1B). Les principaux composants de l’ERG sont (i) la réponse en tension extracellulaire des photorécepteurs, (ii) les transitoires « on » et « off » au début et à la fin du stimulus lumineux qui proviennent des neurones de la lame (Figure 2A, inset, ON, OFF), (iii) la réponse lente des cellules gliales (Figure 2A, encart, flèches), et (iv) la réponse brève et transitoire, résultant d’un déplacement de charge lors de l’activation du photopigment qui précède le transitoire ON¹⁰ (Figure 2C [encart], D, E). Cette réponse brève est composée de deux phases (M1 et M2, Figure 2C [encadré]) et ne peut être induite que par une stimulation lumineuse extrêmement forte, qui active simultanément des millions de molécules de photopigment. Il n’est observé ni sous stimulation bleue (Figure 2D, trace bleue) ni chez les mutants ayant des niveaux de photopigment fortement réduits (Figure 2E, trace rouge), mais son amplitude est légèrement augmentée chez un mutant qui abolit l’activité PLC (Figure 2E, trace orange). La phase M1 est un ERP typique de la mouche résultant de l’activation de M dans les photorécepteurs. La phase M1, qui a une polarité positive (intracellulaire), libère un neurotransmetteur de manière normale dans une synapse inversant les signes et active les neurones de la lame, qui répondent à la dépolarisation des photorécepteurs en générant la phase M2 amplifiée synaptiquement. Ainsi, les phases M1 et M2 reflètent l’activation M^10,11.

La dépolarisation du photorécepteur génère le transitoire « on » cornéen positif, résultant de la synapse d’inversion des signes entre l’axone photorécepteur et les neurones monopolaires de la lame ^10,11 (Figure 1B). La lente montée et la désintégration de l’ERG résultent de la dépolarisation des cellules pigmentaires (Figure 2A, encart, flèches) principalement due à l’efflux K⁺ des cellules photoréceptrices¹² via les canaux ^13,14,15 du potentiel récepteur transitoire (TRP) et TRP-like (TRPL). Ces composants cinétiques lents masquent et déforment en grande partie la forme d’onde de la réponse photoréceptrice par rapport aux enregistrements intracellulaires ou à cellules entières de la réponse photoréceptrice à la lumière ^9,10. De plus, à des éclairements très forts, une réponse transitoire supplémentaire, qui précède et fusionne partiellement avec le transitoire « on », peut être observée (Figure 2C [encart], D,E). Ce signal provient directement de l’activation massive du photopigment¹⁰.

Plusieurs protocoles de régime lumineux utilisant des filtres de densité neutre (ND) et de couleur, ainsi que de forts éclairements, ont été développés pour étudier l’œil en général et la cascade de phototransduction en particulier. Ces protocoles ont également été utilisés pour étudier les propriétés du photopigment.

Le protocole intensité-réponse mesure l’amplitude de crête de la réponse en tension ERG de l’ensemble de l’œil à l’augmentation des intensités lumineuses (Figure 2A, B). Ce protocole aide à détecter les changements dans la sensibilité des cellules photoréceptrices à la lumière⁹.

Le protocole postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite les différences dans les spectres d’absorption de la rhodopsine et de la métarhodopsine qui permet, chez la drosophile, une conversion massive du photopigment de R à son état M intermédiaire physiologiquement actif et stable à l’obscurité². Dans la réponse de tension ERG, une impulsion relativement courte de lumière saturante est donnée et la réponse de tension résultante est enregistrée. Dans cette condition, un plafond (potentiel d’inversion) est atteint par le signal de dépolarisation car l’activation d’une fraction de pourcentage de l’énorme quantité de molécules de rhodopsine (~1 x 10⁸) est suffisante pour atteindre le plafond. La présence des composants de phototransduction en grande abondance garantit que ce plafond sera atteint même chez les mutants avec une réduction significative de la concentration ou un dysfonctionnement subtil des composants de phototransduction. Cette situation empêche l’isolement de ces mutants. Pak et al. ont introduit le dépistage PDA⁷ à la recherche d’un test fiable et révélateur pour isoler les mutants visuels. Chez la drosophile, la réponse PDA est provoquée par l’élimination génétique du pigment de criblage rouge, ce qui permet la conversion du photopigment, et l’application de lumière bleue, qui est préférentiellement absorbée par la rhodopsine (Figure 3A) et, par conséquent, entraîne une conversion nette importante de l’état de photopigment R à M. La terminaison de la phototransduction est perturbée au niveau du photopigment par une conversion nette importante de R en M, ce qui, à son tour, entraîne une excitation soutenue longtemps après l’extinction de la lumière (Figure 2C, Figure 4A [en haut]). Pendant la période PDA, les photorécepteurs sont moins sensibles aux lumières d’essai ultérieures et sont partiellement désensibilisés (inactivés). Le PDA détecte même les défauts mineurs dans la biogenèse de la rhodopsine et teste la capacité maximale de la cellule photoréceptrice à maintenir l’excitation pendant une période prolongée. Comme il dépend strictement de la présence de fortes concentrations de rhodopsine, il obtient facilement des scores pour un réapprovisionnement déficient des composants de phototransduction. Remarquablement, l’écran PDA a donné de nombreux mutants visuels nouveaux et très importants (examinés dans Pak et ^al.7). Ainsi, les mutants PDA isolés par Pak et ^al.7 sont encore extrêmement utiles pour analyser le système visuel de la drosophile .

La PDA est induite chez la drosophile par la saturation de la lumière bleue, ce qui entraîne une dépolarisation continue longtemps après le décalage de la lumière (Figure 4A [en haut]). Après avoir saturé la lumière bleue induisant le PDA, les photorécepteurs périphériques (R1-6) restent continuellement actifs dans l’obscurité à leur capacité maximale, atteignant la saturation. Des lumières bleues saturantes supplémentaires pendant le PDA ne produisent aucune réponse supplémentaire dans les cellules R1-6 pendant de nombreuses secondes, mais induisent une réponse dans les cellules R7-8 qui se superpose au PDA. Les réponses superposées s’expliquent par les différents spectres d’absorption des photopigments exprimés dans ces cellules (R7-8)¹⁶. Le PDA peut être supprimé par la photoconversion de M en R avec une lumière orange saturée (Figure 4A [en haut]). La capacité du PDA à amener les cellules photoréceptrices à leur capacité active maximale, une situation qui ne peut être atteinte par une lumière blanche intense, explique pourquoi il a été un outil majeur pour dépister les mutants visuels de la drosophile. En effet, il permet de détecter même des défauts mineurs dans les protéines impliquées dans la biogenèse des niveaux normaux de photopigment^17,18. Deux groupes de mutants défectueux PDA ont été isolés : ni les mutants inactivation ni les mutants après-potentiel (nina) et les mutants inactivés mais pas les mutants après-potentiels (ina). Le phénotype du premier est l’absence de PDA et l’inactivation associée résultant d’une réduction importante des niveaux de photopigment (Figure 4A [milieu]). Le phénotype de ce dernier montre une inactivation mais pas de dépolarisation sombre après lumière bleue en raison d’un mécanisme encore inconnu chez le mutant avec des niveaux normaux de rhodopsine mais dépourvu de protéines interagissant avec les canaux TRP (Figure 4A [en bas]).

Le PDA résulte de la différence dans la quantité de photopigment par rapport à l’arrestine (ARR2), qui lie et met fin à l’activité M 19,20,21 (Figure 1A). Chez les photorécepteurs de la drosophile, la quantité de photopigment est environ cinq fois plus grande que la quantité d’ARR2¹⁹. Ainsi, les niveaux d’ARR2 sont insuffisants pour inactiver toutes les molécules M générées par une grande photoconversion nette de R à M, laissant un excès de M constamment actif dans l’obscurité 17,19,20,22,23. Ce mécanisme explique l’élimination de la réponse PDA par mutations ou par privation de caroténoïdes^24,25, provoquant une réduction du niveau de photopigment, mais n’affecte pas les niveaux d’arrestine. De plus, cette explication tient également compte des phénotypes de l’allèle²¹ mutant ARR2 nul (arr2³), dans lequel la PDA pourrait être obtenue à des intensités de lumière bleue plus faibles d’environ^{10 fois 19,20,21} (Figure 4B,C). Le PDA n’est pas une caractéristique unique des photorécepteurs de mouches, et il apparaît chez toutes les espèces testées qui ont un M stable sombre avec un spectre d’absorption différent de celui de l’état R, permettant une photoconversion suffisante du photopigment de l’état R à l’état M. Une espèce soigneusement étudiée chez laquelle la phénoménologie PDA a été découverte est le photorécepteur barnacle (Balanus), dans lequel le spectre d’absorption de l’état R est dans une longueur d’onde plus longue que l’état M² (Figure 3B). En conséquence, contrairement à la situation dans la mouche, dans la bernacle, la lumière orange-rouge induit un PDA, tandis que la lumière bleue supprime le PDA².

Le protocole ERP (Early Receptor Potential) exploite le déplacement de charge qui se produit lors de l’activation de R ou M. Le pigment visuel fait partie intégrante de la membrane superficielle du compartiment de signalisation des membranes des vertébrés et des invertébrés³. En conséquence, le processus d’activation dans lequel les molécules de photopigment passent d’un état intermédiaire à l’autre s’accompagne d’un déplacement de charge ^4,26. Comme les molécules de photopigment sont alignées électriquement en parallèle avec la capacité membranaire⁴, un changement conformationnel synchronisé rapide génère un changement de polarisation rapide de la membrane de surface, qui, chez les mouches, se produit dans le compartiment de signalisation composé d’une pile d’environ 30 000 à 50 000 microvillosités appelée rhabdomere. Cette polarisation se décharge ensuite passivement à travers la capacité membranaire du corps cellulaire jusqu’à ce que la membrane cellulaire soit également polarisée. L’ERP est l’enregistrement extracellulaire du déplacement de charge. L’ERP intracellulaire enregistré manifeste l’ERP extracellulaire intégré par la constante de temps de la membrane cellulaire ^4,27,28. Le courant activé par le déplacement de la charge pigmentaire visuelle a également pu être mesuré dans les enregistrements de tension-pince de cellule entière^29,30 (Figure 5A-D), avec l’avantage majeur (dans les enregistrements de courant récepteur précoce (ERC)) de minimiser l’effet de la capacité membranaire sur la cinétique du signal.

La section du protocole décrit comment effectuer des mesures ERG à partir de mesures de l’œil de drosophile ⁹ et des mesures ERC par des enregistrements de cellules entières d’ommatidies isolées de drosophiles ^31,32. Nous décrivons également des protocoles spécifiques qui sont utilisés pour étudier la phototransduction en général et les photopigments en particulier.

1. Mesure de la relation intensité-réponse, de l’après-potentiel dépolarisant prolongé (PDA) et du potentiel récepteur précoce (ERP) à l’aide de l’électrorétinogramme

1. Conditions d’élevage appropriées pour la préparation de D. melanogaster
   1. Élever les mouches D. melanogaster dans des bouteilles contenant du maïs jaune standard contenant de la nourriture dans un incubateur maintenu à une température de 24 ° C et dans un cycle sombre / clair de 12 h
   2. Gardez les bouteilles de mouches dans l’obscurité au moins 24 heures avant l’expérience.
2. Configuration générale
   1. Préparer les pipettes d’enregistrement en tirant des capillaires en verre borosilicate remplis de fibres de 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) (Figure 6L, O). La résistance des pipettes doit être de 5 à 10 MΩ; tout extracteur approprié peut être utilisé.
   2. Enduisez deux fils d’argent avec AgCl₂, en insérant un fil d’argent de 0,25 mm dans une solution KCl de 3 M connectée à une alimentation 5 V sur mesure.
   3. Insérez chaque fil d’argent revêtu dans les porte-électrodes (Figure 6N).
   4. Remplir le capillaire en verre avec la solution de Ringer filtrée (voir tableau 1) à l’aide d’une seringue à pointe allongée (figure 6M).
   5. Insérez l’électrode métallique dans le capillaire en verre. Assurez-vous que la solution dans le capillaire est en contact avec le fil d’argent.
   6. Insérez les porte-électrodes (Figure 7P, N) dans les deux micromanipulateurs d’électrodes (Figure 7G).
3. Procédure de préparation de la mouche pour les enregistrements électriques
   REMARQUE: Pour garder la mouche dans des conditions adaptées à l’obscurité, utilisez uniquement un éclairage de lumière rouge tamisée pendant les étapes suivantes.
   1. Anesthésiez les mouches dans la bouteille avec du gaz CO₂ à l’aide du système de couchette à mouches (Figure 6A, B) et versez-les dans le récipient dormant.
   2. Choisissez une mouche et tenez-la soigneusement par son aile à l’aide d’une pince à épiler tranchante. Couvrez le reste des mouches avec une boîte de Pétri.
   3. Placez la mouche sur le porte-mouches dans la bonne orientation, couchée sur le côté, le dos vers la main (Figure 6P).
   4. Allumez l’alimentation du fer à souder. Réglez le courant sur ~2,25 A. Ce courant doit chauffer le filament de platine-iridium de 0,25 mm à ~55-56 °C (voir Fichier supplémentaire).
   5. Placez une goutte de cire à basse température de fusion (~55-56 °C) sur le fer à souder (Figure 6F).
   6. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la mouche de ses ailes et fixez ses ailes au porte-mouches (Figure 6I) à l’aide du fer à souder.
   7. À l’aide du fer à souder, raccordez le dos de la mouche à la surface du support avec de la cire (Figure 6P).
   8. Abaissez l’extrémité du fer à souder sur le point d’assemblage des pieds et faites fondre la cire pour recouvrir tous les pieds ensemble (Figure 6P).
   9. Placez une petite goutte de cire entre la tête et le dos dans la région du cou (Figure 6P).
      REMARQUE: Prenez des précautions particulières pour éviter de surchauffer la tête de la mouche. Assurez-vous que la mouche est correctement fixée et qu’elle est incapable de bouger pendant l’expérience; des mouvements mineurs peuvent créer des artefacts dans les enregistrements. Assurez-vous que les ouvertures de la trachée (entrées respiratoires) dans le thorax et l’abdomen ne sont pas recouvertes de cire.
   10. Placez le porte-mouches (Figure 7Q) dans une cage de Faraday sombre sur un bloc magnétique (Figure 7I) et assurez-vous que la mouche se trouve à environ 5 mm de l’extrémité du guide de lumière (Figure 7L).
   11. Placez l’électrode d’enregistrement (Figure 7P) au-dessus de l’œil de la mouche et l’électrode de masse (Figure 7N) sur le haut du dos de la mouche à l’aide des micromanipulateurs.
   12. Insérez l’électrode de terre à l’arrière de la mouche à l’aide des micromanipulateurs.
   13. Insérez l’électrode d’enregistrement dans la périphérie externe de l’œil de la mouche, de préférence, à l’aide des micromanipulateurs.
       REMARQUE: Après avoir inséré l’électrode dans l’œil, une petite fossette sera observée; tirez l’électrode vers le haut sans la retirer de l’œil jusqu’à ce que la fossette disparaisse. Les électrodes peuvent également être immergées dans de petites gouttelettes de gelée d’électrode appliquées au niveau du torse et de l’œil.
4. Protocole intensité-réponse
   1. Placez un filtre orange (filtre à bord 590) devant la lampe au xénon haute pression. Utilisez un grand filtre (six ordres de grandeur) de densité neutre (ND) atténuante.
   2. Attendez 60 s dans l’obscurité et donnez une impulsion lumineuse de 5 s.
   3. Remplacez le filtre ND par un filtre ND moins atténuant par incréments d’un ordre de grandeur.
   4. Attendez 60 s dans l’obscurité et donnez une deuxième impulsion lumineuse de 5 s.
   5. Répétez les étapes 1.4.1.-1.4.4, en augmentant progressivement l’intensité lumineuse à l’aide de filtres ND moins atténuants (la dernière impulsion doit être générée sans filtre ND du tout). Assurez-vous d’utiliser la série de filtres ND dans la bonne direction, en partant d’une grande atténuation et en atteignant une faible atténuation.
5. Protocole PDA (ce protocole ne peut être effectué que sur des mouches aux yeux blancs)
   1. Donnez une impulsion lumineuse de 5 s d’intensité maximale à l’aide d’un filtre orange (filtre à bords 590, pour convertir le photopigment maximal à l’état R).
   2. Remplacez le filtre orange par un filtre bleu à large bande (BP450/40 nm) et donnez trois impulsions lumineuses de 5 s à l’intensité maximale.
      REMARQUE: Il est également possible de donner une longue impulsion de lumière bleue d’intensité maximale continue jusqu’à ce qu’une réponse de tension à l’état d’équilibre soit atteinte.
   3. Attendez 60 s dans l’obscurité, remplacez le filtre bleu par le filtre orange précédent et donnez deux impulsions lumineuses de 5 s avec des intervalles de 60 s.
6. Protocole de potentiel ERP/M pour mesurer le spectre de photo-équilibre de M (ce protocole ne peut être effectué que sur des mouches aux yeux blancs^10,25)
   1. Donnez une impulsion lumineuse bleue continue (passe-bande (BP) 450/40 nm) jusqu’à ce qu’elle atteigne une réponse de tension à l’état stable, ce qui convertit la quantité maximale de photopigment de l’état R à l’état M des cellules R1-6.
   2. Donner un bref flash lumineux intense (<3 ms) d’une longueur d’onde comprise entre 350 et 700 nm (le spectre d’absorption connu du photopigment des cellules R1-6) à l’aide de filtres passe-bande étroits (~20 nm) et mesurer l’amplitude maximale de la phase M1 de la réponse potentielle M (qui reflète l’absorption de la métarhodopsine à cette longueur d’onde spécifique au photo-équilibre^10,25).
      REMARQUE: Pour l’activation synchrone d’un grand nombre de molécules de photopigment, un bref éclair de lumière intense est nécessaire pour que la teneur en photons soit emballée dans une courte durée. Le potentiel M est composé de deux composantes : M1 (phase cornéenne négative), qui reflète le déplacement de charge de la métarhodopsine dans le photorécepteur, et M2 (phase cornéenne positive^11,33), qui reflète la réponse M1 amplifiée des photorécepteurs dans la lame ^9,10,11 . Chacun de ces composants peut être identifié et mesuré. Cependant, il est préférable de mesurer le potentiel M1 puisqu’il s’agit d’une manifestation linéaire directe des niveaux M. Si M2 est utilisé, assurez-vous que son amplitude est dans la gamme linéaire en utilisant une légère privation de caroténoïdes^24,25.
   3. Donnez à nouveau une impulsion lumineuse bleue continue (BP450/40 nm), suivie d’un bref flash lumineux intense (<1 ms) d’une longueur d’onde différente.
   4. Répétez ce protocole jusqu’à ce que tout le spectre d’absorption de M à l’équilibre photo soit couvert.

2. Protocole ERC pour mesurer le spectre d’action des états R et M des cellules R1-6 à l’aide d’enregistrements de tension-pince à cellules entières

REMARQUE: Pour un protocole détaillé pour l’utilisation des enregistrements de tension de cellule entière, voir Katz et ^al.34. Le potentiel M utilise l’ERG pour mesurer l’activation de l’état M uniquement parce que la contribution de l’état R est supprimée par la capacité membranaire. En revanche, l’ERC mesure l’activation des états R (ERC positif) et M (ERC négatif) parce que les enregistrements de tension-pince éliminent l’effet de la capacité membranaire (voir introduction).

1. Convertissez le photopigment à l’état souhaité (R ou M). Pour la conversion R en M, tout d’abord, adaptez les mouches par un bref flash bleu adaptatif (BP450/40 nm) (<1 ms). Pour la conversion M en R, donnez un court flash orange adaptatif (filtre de bord OG590).
2. Donnez un bref flash lumineux (<1 ms) d’une longueur d’onde comprise entre 350 et 700 nm et mesurez l’amplitude maximale négative ou positive de la réponse ERC, qui reflète l’absorption M/R à cette longueur d’onde spécifique.
   REMARQUE: Pour l’activation synchrone d’un grand nombre de molécules de photopigment, un bref éclair de lumière intense est nécessaire pour emballer la teneur en photons en une courte durée. La conversion maximale du photopigment de R à M par flash bleu peut atteindre environ 80 % du total des molécules de photopigment en raison du chevauchement du spectre d’absorption de R et M (Figure 3A). Par conséquent, à des longueurs d’onde inférieures à ~550 nm, l’ERC a deux composantes: une phase négative qui reflète la réponse de la métarhodopsine et une phase positive qui reflète la réponse de la rhodopsine restante. L’ERC dépend linéairement de l’intensité lumineuse (Figure 5D). En conséquence, pour dériver la sensibilité spectrale des états R et M, chaque phase de l’ERC doit être normalisée aux différentes longueurs d’onde pour une énergie égale²⁹.
3. Répétez les étapes 2.1.-2.2. en utilisant des flashs de différentes longueurs d’onde.
4. Tracez l’ERC positif et négatif normalisé en fonction de la longueur d’onde.
   REMARQUE: Le fort flash de lumière induit un courant massif à travers les canaux sensibles à la lumière conduisant à un stress métabolique sur le photorécepteur, ce qui, à son tour, provoque une ouverture de canal indépendante de la lumière. Le CER se superpose à ce courant constitutif.

La figure 2 illustre la robustesse et la facilité d’utilisation de la technique ERG. Il est robuste car il est enregistré dans la mouche pratiquement intacte par une technique simple d’enregistrements de tension extracellulaire qui nécessitent une configuration électrophysiologique simple. La robustesse se manifeste par l’obtention d’enregistrements de réponses lumineuses avec des amplitudes relativement grandes (de l’ordre du millivolt) même lorsque les mutations réduisent fortement ou déforment la réponse lumineuse. Par conséquent, même un expérimentateur inexpérimenté peut utiliser la configuration expérimentale très simple et apprendre à obtenir des résultats significatifs en quelques jours. L’objectif principal de la technique conçue pour mesurer les niveaux de photopigment est atteint par des méthodes extrêmement simplifiées du PDA (Figure 2C) et de l’ERP (Figure 2C-E). L’alternative, à savoir la microspectrophotométrie, nécessite un équipement optique coûteux ainsi qu’une formation et des compétences considérables (figure 3B). Le CER (figure 5A-D), bien que techniquement difficile, est moins sensible à la préservation cellulaire; il se caractérise par un rapport signal/bruit élevé et l’élimination de la capacité membranaire.

Figure 1 : Le cycle photochimique : l’activation et la désactivation du photopigment. (A) L’éclairage bleu saturé (flèche bleue ondulée) photoconvertit la rhodopsine (R) en métarhodopsine (M). La phosphorylation multiple de M par la rhodopsine kinase et la liaison ultérieure de l’arrestine 2 (ARR2) inactivent M. La lumière orange (flèche rouge ondulée) photoconvertit M non phosphorylé en R. Le M non phosphorylé active la protéine G hétérotrimérique (Gq_αβγ), provoquant la dissociation de Gq_α de Gq_βγ et l’échange de GDP lié avec le GTP cytoplasmique. Gq_α-GTP active alors la phospholipase C (PLC), qui hydrolyse PIP₂ en diacylglycérol (DAG) et en inositol trisphosphate (IP₃), activant ainsi les canaux TRP/TRPL d’une manière encore peu claire. La kinase dépendante de la calmoduline Ca²⁺ (CaMKII) phosphoryle le complexe M pp-ARR2 et subit une endocytose et une dégradation dépendantes de la clathrine. L’éclairage à la lumière orange (flèche rouge ondulée) photoconvertit le complexe M pp-ARR2 en R phosphorylé (R_pp), libérant ARR2 dans le cytosol. Le R phosphorylé (R_pp) subit une déphosphorylation par la rhodopsine phosphatase (rdgC), produisant R prêt pour un autre cycle du photopigment. (B) Profil de profondeur de l’ERG de la mouche aux yeux blancs à un stimulus blanc de 1 s (colonne centrale) ou à un flash stroboscopique blanc (colonne de droite). Les stimuli sont indiqués par des barres ou des points sous les traces. Les traces sont disposées verticalement par ordre de profondeur, avec la trace supérieure enregistrée à environ 10 μm sous la cornée, chaque enregistrement ultérieur étant 25 μm plus profond que le précédent. Sur la gauche se trouve un dessin lucida de caméra d’une section correspondante à travers un autre œil, indiquant la rétine, la membrane basale (BM), l’écorce laminaire, les cartouches laminaires (sectionnées obliquement) et la croûte médullaire. Ce chiffre a été modifié à partir de Stephenson et Pak¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Enregistrements par électrorétinogramme (ERG) des réponses lumineuses de type sauvage aux yeux blancs (w¹¹¹⁸) et de la drosophile mutante montrant la relation intensité-réponse, l’après-potentiel dépolarisant prolongé (PDA) et le potentiel de métarhodopsine (potentiel M). (A) Relation intensité-réponse d’une mouche WT (w¹¹¹⁸) obtenue par une série de lumières orange (filtre de bord OG590, l’énergie totale émise par le bord du guide de lumière à l’aide du filtre orange était de 4 mW) avec une intensité lumineuse croissante indiquée à l’échelle logarithmique. L’encart affiche la réponse indiquée sur une échelle de temps plus rapide. Encadré : Les principaux composants de l’ERG sont la réponse en tension extracellulaire du photorécepteur (potentiel récepteur), les transitoires « on » et « off » (on, OFF response) au début et à la fin du stimulus lumineux, et la réponse lente des cellules gliales (flèches). (B) L’amplitude de crête moyenne des réponses ERG est tracée en fonction de l’intensité lumineuse relative. (C) L’ERP d’une mouche WT (w¹¹¹⁸) a été obtenue par l’application d’une lumière bleue saturante (BP450/4 nm, l’énergie totale émise par le bord du guide lumineux à l’aide du filtre bleu était de 1 mW) qui induit initialement un PDA. L’ERP (encart) a été obtenu par un flash vert intense (~ 70 J, durée de 2 ms) (flèche, filtre d’interférence à large bande de 550 nm), qui a supprimé le PDA. Encadré : les différentes composantes de l’ERP comprennent le potentiel M1 négatif cornéen et le potentiel M2 positif, comme indiqué. Un résidu sur transitoire (réponse « ON ») est également indiqué. (D-E) La conversion du photopigment est nécessaire pour l’induction du potentiel M : le potentiel (D) M a été obtenu par un flash vert (filtre d’interférence à large bande de 550 nm) après adaptation bleue mais pas par un flash bleu (BP450/4 nm) après adaptation bleue en MOUCHE (w¹¹¹⁸). (E) Le protocole de D a été répété chez WT (w¹¹¹⁸, trace noire) et deux mouches mutantes (plc null mutant, norpA^P24, trace orange, et mutant hypomorphe rhodopsine, ninaE^P318, trace rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Spectres d’absorption des photopigments des mouches et des bernacles. (A) Spectres d’absorption relatifs de la rhodopsine (R) et de la métarhodopsine (M) des mouches calculés à partir de mesures photométriques du spectre de différence et du spectre de photo-équilibre. Ce chiffre a été modifié à partir de Selinger et Minke³⁵. (B) Deux nomogrammes Dartnall avec des longueurs d’onde de crête à 492 nm et 532 nm, avec un rapport d’absorption de crête de 1,63:1, respectivement. La différence entre ces courbes donne le meilleur ajustement au spectre de différence mesuré à partir des ocelles de la bernacle Balanus eborneus, obtenu par des mesures de transmission dans la gamme de 400-650 nm après saturation de l’adaptation du bleu monochromatique (442 nm) et de l’orange (596 nm). Ce chiffre a été modifié à partir de Minke et Kirschfeld³⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Phénotype PDA des mutants nina, ina et Arr2. (A) Le protocole d’induction et de suppression de la PDA chez la drosophile. Le protocole d’induction PDA est composé d’un éclairage initial utilisant une impulsion lumineuse orange d’intensité maximale (filtre de bord 590, l’énergie totale émise par le bord du guide de lumière à l’aide du filtre orange était de 4 mW, barre orange) suivie de l’application de trois impulsions de lumière bleue d’intensité maximale (les 2^ème et^3ème impulsions sont destinées à vérifier l’atteinte du PDA maximal, Filtre BP450/40 nm, l’énergie totale émise par le bord du guide de lumière à l’aide du filtre bleu était de 1 mW, trois barres bleues). La suppression du PDA a été obtenue par l’application de l’impulsion lumineuse orange suivie de l’application d’une lumière orange supplémentaire (deux barres orange). Le protocole d’induction et de suppression de la PDA a été répété dans le mutant aux yeux blancs du gène structurel du photopigment R1-6, ninaE^{P318 7} (milieu). Le protocole d’induction et de suppression de la PDA a également été répété dans le mutant nul aux yeux blancs de la protéine kinase C (PKC³²) spécifique de l’œil inaC^P209 (en bas). (B) Une comparaison entre la quantité de lumière bleue nécessaire à l’induction d’un PDA entre le WT aux yeux blancs (W¹¹¹⁸) et le mutant Arr2 nul (Arr2³). Un train d’impulsions lumineuses alternées orange (saturer 590 filtres de bord) et bleues (BP450/40 nm) d’intensités lumineuses croissantes (ND à l’échelle relative -log). À une lumière bleue d’intensité -log 1, un PDA est induit (en haut). Le paradigme de la trace supérieure a été répété dans le mutant Arr2³ montrant que le PDA a été induit à la lumière bleue d’une intensité de lumière plus faible d’environ 10 fois (-log 2) (en bas). (C) Un train d’impulsions de lumière bleue sombre (-log 2) d’intensité constante n’a pas réussi à induire un PDA dans W¹¹¹⁸ fly (à gauche), tandis que le même train de lumières bleues sombres a induit un PDA par la 1^ère impulsion lumineuse dans le mutant Arr2³ (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Enregistrements sur cellules entières des réponses lumineuses d’ommatidies isolées, enregistrés à partir de WT aux yeux blancs (w¹¹¹⁸), montrant la génération de courant récepteur précoce (ERC) et sa relation intensité-réponse. (A) Enregistrements de cellules entières à pince de patch à partir d’ommatidium isolé de mouche WT (w¹¹¹⁸) de réponse ERC biphasique avec une latence inférieure à la microseconde. Le stimulus lumineux est composé d’une stimulation intense (~220 J, durée de 0,8 ms) de lumière bleue (filtre large bande avec absorption maximale à 425 nm, flèche) appliquée après une forte adaptation au jaune-vert (filtre large bande avec absorption crête à 546 nm de lumière, trace noire). Au début de la lumière, un artefact électrique négatif rapide est observé. La phase négative découle de l’activation de M, et la phase positive découle de l’activation de R. L’activation du courant induit par la lumière (LIC) se manifeste par la phase négative retardée résultant de l’ouverture des canaux sensibles à la lumière. Le mutant nul ninaE^I17 a montré un manque de réponse ERC au même flash lumineux appliqué à l’ommatidium isolé (trace rouge). (B) Mesure ERC des photopigments Rh1 enregistrés à partir de la même cellule que (A). La trace noire montre une réponse négative mono-phasique (état M) à la stimulation par flash orange de la mouche WT (w¹¹¹⁸) après une forte adaptation à la lumière bleue. (C) Échantillon de traces ERC biphasiques mesurées à partir d’une seule cellule photoréceptrice de drosophile transgénique (opn4;ninaE^I17) exprimant ectopiquement le photopigment de mélanopsine de souris (opn4) dans des photorécepteurs de mouches R1-6 en réponse à l’intensité croissante des flashs blancs (sur une échelle relative -log I; ND indique des filtres de densité neutre). L’apparition du flash est indiquée par la flèche. (D) L’augmentation de l’intensité lumineuse s’est manifestée par une augmentation linéaire de l’amplitude ERC de l’opn4;ninaE^I17. Graphique de l’amplitude de crête moyenne de la phase négative des réponses ERC (échelle logarithmique) en fonction de l’intensité lumineuse relative (I/I_max, également à l’échelle logarithmique). La ligne droite continue représente une courbe de régression linéaire qui correspond le mieux aux points expérimentaux (R² = 0,99, les barres d’erreur sont SEM, n = 5). Ce chiffre a été modifié à partir de Yasin et ^al.29. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6: Outils et dispositifs nécessaires à la fixation des mouches et à l’enregistrement de la préparation de la pipette. (A) Système de traverses à mouches; B) Pédale du système de traverses de mouche; C) Source de lumière froide; D) Microscope stéréoscopique; E) Réchauffeur de filament de cire; F) Fer à souder; G) Pédale de chauffage à filament de cire; H) Pinces rugueuses; I) Support de mouche magnétique; J) Cire à basse température de fusion; K) Lingettes délicates; L) Extracteur de pipette vertical; (M) Seringue à pointe allongée; N) Porte-électrodes; O) capillaires en verre borosilicate; (P) Mouche fixe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Vue d’ensemble de la configuration ERG. (A) Générateur d’impulsions ; B) Ordinateur; C) Convertisseur A/N; D) Amplificateur; E) Microscope stéréoscopique; F) Micromanipulateur (fin mécanique); G) Système de préamplificateur à microélectrodes avec étage de tête; H) Table antivibratoire; (I) Bloc magnétique marche / arrêt; J) Micromanipulateur (mécanique grossier); K) Cage de Faraday; (L) Guide de lumière de la source lumineuse au xénon; (M) Guide de lumière du système de lumière flash; (N) Porte-électrode de masse; O) Détecteur de lumière; P) Porte-électrode d’enregistrement; (Q) Support de mouche magnétique; R) Alimentation de la lampe au xénon; (S) Les filtres de couleur et ND sont debout; T) Banc optique; (U) Système de lampe flash; (V) Pilote d’obturateur; (W) Alimentation de la lampe; (X) Système de lampe flash au xénon Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition de la solution de Ringer.

Fichier supplémentaire 1: Schéma de circuit du régulateur de fusion de cire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Le principal avantage de l’utilisation de la préparation de photorécepteurs de drosophile est son accessibilité, la facilité et la précision de la stimulation lumineuse et, surtout, la capacité d’appliquer la puissance de la génétique moléculaire⁷. Des études génétiques approfondies ont établi la drosophile comme un système modèle extrêmement utile pour la dissection génétique de processus biologiques complexes⁷. La structure relativement simple du génome de la drosophile (composé de seulement quatre chromosomes, y compris les chromosomes sexuels X et Y, deux éléments autosomiques plus grands, les chromosomes 2 et 3, et le petit chromosome quatrième point), la facilité de croissance et le temps de génération rapide (~ 2 semaines à 24 ° C) rendent la drosophile apte au dépistage d’un grand nombre de mouches individuelles mutagénisées. De plus, l’isolement et le maintien de toute mutation isolée deviennent possibles grâce à la génération de chromosomes d’équilibre, contenant des marqueurs dominants et de multiples inversions, qui empêchent la recombinaison avec les chromosomes natifs. Les outils moléculaires disponibles ont permis d’étudier des produits génétiques modifiés in vitro dans leur environnement cellulaire natif³⁷. Cette méthodologie puissante a produit une pléthore de mouches mutantes avec des défauts dans de nouvelles protéines qui auraient autrement été difficiles à prédire⁷.

Le principal avantage de l’utilisation de l’ERG pour les mesures des niveaux de photopigment et de la sensibilité à la lumière est sa simplicité et sa facilité d’application et son rapport signal/bruit important. L’inconvénient de l’utilisation de l’ERG est son origine cellulaire hétérogène, déformant la forme d’onde de la réponse lumineuse provenant des photorécepteurs⁹. Le principal avantage des enregistrements de cellules entières à pince de tension est la possibilité de dériver le changement de conductance en mesurant la relation courant-tension (I-V). L’ouverture et la fermeture des canaux TRP et TRPL pendant et après l’éclairage sont reflétées par cette mesure¹³. En outre, un rapport signal/bruit élevé est obtenu en raison de la faible résistance de la pipette d’enregistrement (~10 MΩ) et de la mesure des courants, permettant des mesures fiables des bosses quantiques (réponses monophotoniques), ce qui est utile pour calibrer l’intensité lumineuse effective³⁸. Un inconvénient majeur des enregistrements de cellules entières patch-clamp est que, bien que les enregistrements ERG puissent être maintenus pendant des heures, même sous des intensités lumineuses extrêmes, il est difficile d’effectuer des enregistrements fiables de cellules entières patch-clamp pendant plus de 15 à 30 minutes, et une stimulation par faible luminosité est nécessaire pour les enregistrements prolongés. Pour obtenir des enregistrements de cellules entières, un contact direct entre la pipette d’enregistrement et la membrane photoréceptrice est nécessaire. Le contact direct est obtenu en enlevant les cellules pigmentaires (gliales) entourant les ommatidies³⁴ (Figure 1B). L’élimination des cellules pigmentaires provoque un stress métabolique parce que la cellule photoréceptrice ne peut pas synthétiser les métabolites nécessaires à la production d’adénosine triphosphate (ATP), perturbant l’approvisionnement métabolique³⁹. Étant donné que les canaux TRP et TRPL sont vulnérables à l’anoxie et s’ouvrent facilement spontanément dans l’obscurité en raison de l’épuisement de l’ATP, l’utilisation d’ommatidies isolées impose une grande difficulté^40,12. Toute la procédure doit être effectuée sous une lumière rouge tamisée car la réponse lumineuse induit une grande consommation d’ATP³⁴.

La plupart des mutations dans la cascade de phototransduction induisent une diminution de la sensibilité à la lumière. Cette réduction de la sensibilité à la lumière peut être facilement détectée par un écran basé sur la mesure de la relation intensité-réponse. Les paradigmes intensité-réponse sont obtenus par des stimulations lumineuses répétées avec une intensité croissante sur une échelle logarithmique. Il est nécessaire d’augmenter (et non de diminuer) l’intensité de la lumière orange pour empêcher l’adaptation à la lumière. L’ERG (M-potentiel) et le PDA sont des méthodes très simples de mesure des niveaux de photopigment. L’alternative, à savoir la microspectrophotométrie³⁶, nécessite un équipement optique coûteux et une formation et des compétences considérables.

Pour conclure, le GRE est un outil simple à appliquer mais relativement imprécis. L’enregistrement de cellules^{entières 31} est précis pour mesurer les niveaux de photopigment à l’aide de l’ERC, et il est essentiel pour compenser l’imprécision et les limites de l’ERG.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Cette recherche a été soutenue par des subventions de la Fondation israélienne pour la science (ISF) et de la Fondation scientifique binationale États-Unis-Israël (BSF). Nous remercions M. Anatoly Shapochnikov pour la construction du réchauffeur de filament de cire.