Method Article
Par spectroscopie de résonance paramagnétique (EPR) est une méthode non équivoque pour mesurer des radicaux libres. L’utilisation de sondes de spin sélectif permet une détection des radicaux libres dans les différents compartiments cellulaires. Nous présentons une méthode pratique et efficace pour collecter des échantillons biologiques qui facilitent le traitement, stockage et transfert des échantillons pour des mesures de l’EPR.
La détection précise et spécifique des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les différents compartiments cellulaires et tissulaires est essentielle à l’étude de l’oxydo-réduction réglementées de signalisation dans les milieux biologiques. Spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) est la méthode directe d’évaluer sans ambiguïté les radicaux libres. Son avantage est qu’il détecte des niveaux physiologiques des espèces spécifiques avec une grande spécificité, mais elle requiert la technologie spécialisée, préparation minutieuse et des contrôles appropriés afin d’assurer une interprétation précise des données. Sondes de spin hydroxylamine cyclique réagissent sélectivement avec superoxyde ou autres radicaux pour générer un signal nitroxyde pouvant être quantifiées par spectroscopie RPE. Sondes de spin perméable à la cellule et sondes de spin conçus pour accumuler rapidement dans les mitochondries permettent la détermination de la concentration de superoxyde dans les différents compartiments cellulaires.
Dans les cellules cultivées, l’utilisation de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine cellulaires perméables (CMH) avec et sans prétraitement de cellule-imperméable superoxyde dismutase (SOD) ou de cellules perméables PEG-SOD, permet la différenciation des extracellulaire de superoxyde cytosolique. Le 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitochondrial] pipéridinium dichlorure (mito-TEMPO-H) permet de mesurer des ROS mitochondriale (principalement le superoxyde).
Sondes de spin et spectroscopie RPE peuvent également être appliquées en vivo modèles. Superoxyde peut être détectée en fluides extracellulaires comme le sang et le liquide alvéolaire, ainsi que les tissus tels que les tissus pulmonaires. Plusieurs méthodes sont présentées pour traiter et stocker les tissus pour les mesures de l’EPR et livrer de sonde 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine en intraveineuse (CPH) spin in vivo. Tandis que les mesures peuvent être réalisées à température ambiante, échantillons obtenus à partir des modèles in vitro et in vivo peuvent également être stockées à-80 ° C et analysés par EPR à 77 K. Les échantillons peuvent être stockés dans l’écurie de tubes spécialisés à-80 ° C et exécutées à 77 K pour permettre une pratique, efficace et une méthode reproductible qui facilite le stockage et transfert des échantillons.
Alors que les mesures du stress oxydatif et les espèces réactives de l’oxygène sont importants pour l’étude de diverses maladies à travers tous les systèmes organiques, la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est difficile en raison d’une courte demi-vie et forte réactivité. Une technique de résonance paramagnétique (RPE) des électrons est la méthode la plus claire pour la détection des radicaux libres. Sondes de spin ont des avantages sur des sondes fluorescentes plus couramment utilisés. Bien que des sondes fluorescentes sont relativement peu coûteux et facile à utiliser et offrant une détection rapide et sensible de ROS, ils ont de sérieuses limites à cause des signaux artéfactuelle, une incapacité à calculer les concentrations de ROS et un manque général de spécificité1 .
Pour faciliter l’utilisation de l’EPR pour des études biologiques, une variété de spin sondes ont été synthétisés qui permet de mesurer une gamme d’espèces radicalaires biologiquement pertinente ainsi que pO2, pH et redox indique2,3, 4,5,6,7. Pièges à spin ont également été développés pour capter les radicaux éphémères et forme longue durée de vie des adduits, qui facilite la détection par RPE8. Les deux classes (sondes de spin et pièges à spin) ont des avantages et des limites. Une classe couramment utilisée des sondes de spin sont des hydroxylamines cycliques, qui sont des EPR en silence et réagissent avec des radicaux pour former un nitroxyde stable de courte durée. Hydroxylamines cycliques réagissent avec le superoxyde 100 fois plus vite que les pièges à spin, ce qui leur permet de rivaliser avec les antioxydants cellulaires, mais ils manquent de spécificité et nécessitent l’utilisation de contrôles appropriés et les inhibiteurs d’identifier les espèces radicalaires ou source responsable pour le signal nitroxyde. Tandis que spin intercepte la spécificité de la pièce, avec distinctes spectrale que modèles selon l’espèce pris au piège, ils ont cinétique lente pour superoxyde spin piégeage et sont sujette à la biodégradation du radical adduits. Demandes de piégeage de spin ont été bien étudiées dans la recherche biomédicale9,10,11,12,13.
L’objectif de ce projet est de démontrer les méthodes pratiques d’EPR pour concevoir des expériences et préparation des échantillons pour détecter des superoxyde à l’aide de spin des sondes dans les différents compartiments cellulaires in vitro et dans des tissus différents compartiments in vivo. Plusieurs manuscrits ont publié les protocoles pertinents à atteindre ces objectifs, en utilisant des sondes de spin ciblées perméable à la cellule et cellule-imperméable mitochondriale au tissu de cible différents compartiments cellulaires in vitro et processus pour analyse dans des modèles murins 14 , 15. nous inspirer de ce corpus de textes en validant une approche pour mesurer la superoxyde en utilisant une sonde de spin (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine dans différents compartiments cellulaires in vitro afin d’assurer la précision mesures, mettant en évidence les éventuels problèmes techniques qui peuvent biaiser les résultats. Nous fournissons également des méthodes permettant d’effectuer des mesures de l’EPR dans le sang, le liquide de lavage broncho-alvéolaire et du tissu pulmonaire à l’aide de la sonde de spin CMH. Ces études comparent différentes méthodes pour traiter les tissus ainsi que pour présenter une méthode pour injecter une autre sonde de spin, CPH, à des souris avant la récolte de tissus. Enfin, nous développons une méthode pratique pour stocker les échantillons dans un tube de polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour permettre le stockage et le transfert des échantillons avant mesures EPR à 77 K.
Toutes les études animales ont été approuvés par l’Université du Colorado Denver institutionnels et animalier Comité d’urbanisme.
1. préparation des réactifs
2. détection de superoxyde in vitro
3. EPR mesures dans les fluides
4. EPR mesures sur des tissus pulmonaires
5. analyse
Détection de superoxyde par CMH a été validée à l’aide de le X / superoxyde XO centrale système de démontrer que le signal nitroxyde (CM.) est totalement inhibé par SOD, tandis que catalase n’a eu aucun effet (Figure 1 a). Le superoxyde total, extracellulaire était alors évaluée en 264.7 cellules crues par incubation des cellules avec la sonde de spin CMH perméable à la cellule +/-un prétraitement SOD. La concentration de nitroxyde a été mesurée dans la suspension cellulaire et la mémoire tampon, qui a démontré que les valeurs dans les deux types d’échantillon étaient similaires en raison de la nature perméable et l’équilibration rapide de la sonde de spin (Figure 1 b). Le signal de radical nitroxyde a augmenté en RAW 264.7 cellules stimulées avec PMA par rapport aux cellules contrôles. Ce signal a été considérablement atténué dans les cellules pré-traitées avec SOD imperméable au cellulaire (Figure 1). Chaque couleur représente puits testés sur des jours différents, ce qui démontre la cohérence des données recueillies sur certains jours et la reproductibilité des résultats au fil du temps. La concentration du superoxyde extracellulaire a été déterminée en soustrayant le signal dans les cellules PMA prétraités avec SOD du signal après PMA en l’absence de SOD (T). Le signal reste a été attribué à superoxyde intracellulaire (Figure 1). La figure 1 illustre le calcul du total et extracellulaire de superoxyde. (E) le signal intracellulaire a été confirmé dans les cellules traitées PMA après l’enlèvement des médias et par l’effet du PEG-SOD sur le signal. Dans ce graphique, contrairement à (C), le CMH vide ne était pas soustrait les mesures, et les données brutes sont affichées.
Mitochondrial superoxyde dans les 264.7 cellules crues a été détectée à l’aide de l’EPR spin sonde mito-TEMPO-H, qui s’accumule dans les mitochondia. (A) les spectres EPR représentant le signal de mito-TEMPO-H de base dans la mémoire tampon, l’intensification de la mito-TEMPO-H dans les cellules de contrôle (Con) et le signal le plus amélioré dans les cellules stimulées avec l’inhibiteur mitochondrial l’Antimycine A (AA). L’augmentation du signal a été attribuée à la superoxyde mitochondrial issu de notre précédente étude montrant que la surexpression de SOD2 mesures sensiblement atténués avec mito-TEMPO-H10. Dans la Figure 2 b, la concentration de nitroxyde mitochondriale a été déterminée en soustrayant le signal mito-TEMPO-H dans le tampon apparié dans le temps de la mesure de la cellule. Le signal de CM. obtenu à des températures basses dans les 264.7 cellules crues après stimulation par les PMA en présence et en absence de SOD. (Figure 3 a) Le signal de CM. a été atténué en présence de SOD, cohérente avec les données de température de la pièce (Figure 1). Figure 3 b montre la photo du tube PTFE avec les bouchons utilisés pour recueillir des données à 77 K pour les piles et in vivo des échantillons. Production de superoxyde a été détectée dans le sang et BALF à l’aide de la sonde de spin CMH. Les échantillons de sang ou BALF ont été prélevés sur PBS et Bleo-souris et incubées immédiatement avec CMH. Les échantillons ont été transférés à la tuyauterie de PTFE et le flash congelés et EPR données ont été recueillies à 77 K. La concentration de nitroxyde (CM.) s’accumulent dans le sang incubée avec CMH (0,2 mM) à 37 degrés pendant 10 min (Figure 4 a). Nitroxyde (CM.) concentration de BALF incubé pendant 50 min (Figure 4 b). Nitroxyde concentration représente la concentration de CM (.) accumulée dans le volume de sang ou BALF utilisées pour l’expérience.
Trois méthodes ont été testées pour évaluer plusieurs techniques publiées pour la préservation des tissus et l’administration de spin sondes ex vivo vs. in vivo. Pour effectuer des mesures de l’EPR sur les tissus pulmonaires, nous avons tout d’abord utilisé du tissu pulmonaire congelés flash de contrôle ou blessé souris. Figure 5 a montre le signal CM. dans le surnageant d’un petit morceau de tissu pulmonaire sont incubé à 37 ° C avec CMH chez les souris traitées PBS - et Bleo, respectivement. En raison de l’hétérogénéité de la lésion pulmonaire après traitement Bleo, il est recommandé de couper les morceaux de différentes régions du poumon et la moyenne de plusieurs mesures pour fournir une valeur plus représentative. Alternativement, on peut homogénéiser l’ensemble du poumon et utiliser un échantillon de cette homogénat. Les données recueillies à 77 K, utilisez un tuyau de PTFE et le doigt dewar. Figure 5 b montre les spectres représentatifs des signaux nitroxyde (CM.) de PBS et Bleo-souris, respectivement.
Une des limitations de traiter les tissus pulmonaires ex vivo est qu’il n’est pas possible de distinguer sûrement extracellulaire de superoxyde intracellulaire en raison de la transformation du tissu qui perturbe les membranes cellulaires. Si cette information est importante pour la question expérimentale, il peut être adressée par la méthode en vivo CPH instillation décrites ci-dessous. Gelées de tissu ne peuvent servir à évaluer le superoxyde mitochondrial ; Cependant, pour cette mesure, le protocole peut être adapté pour utiliser mito-TEMPO-H dans le tissu ou les mitochondries fraîchement isolées.
Comme une seconde méthode pour les mesures de l’EPR dans les tissus pulmonaires, tissu frais a été homogénéisé dans un tampon saccharose. L’homogénat de poumon est incubé avec sonde CMH dans un tampon KHB contenant DTPA. EPR mesures ont été prises out à RT. Figure 6 a montre l’augmentation de CM. avec Bleo. Nous avons présenté un test supplémentaire à l’aide de différents inhibiteurs qui peuvent être utilisées pour déterminer les espèces qui contribuent à la CM. signal. Afin d’élucider l’origine de CM. signal généré à partir du tissu pulmonaire, nous prétraités les homogénats de poumon avec plusieurs charognards et les inhibiteurs d’enzymes. Des homogénats de poumon ont été incubées avec CMH en l’absence ou la présence de chlorure SOD, déféroxamine (MPO) et diphényliodonium (DIP) pour tenir compte de (respectivement) pour les contributions de superoxyde, fer ou superoxyde générés de flavine enzymes (Figure 6 b). Cette approche peut être adaptée pour évaluer les espèces radicalaires spécifiques générées dans un système ou d’élucider la contribution des autres sources enzymatiques (e.g., NOX, eNOS ou xanthine oxydase).
Souris ont été injectés avec le CPH spin sondes (20 mg/kg) via la route retroorbital pour effectuer des EPR mesures in vivo. On ne sait pas si CMH peut être administré sans danger pour les animaux, alors que la sonde CPH a été signalée à être non toxique ; ainsi, nous avons choisi le CPH pour les expériences in vivo . Tissus pulmonaires ont été récoltés et flash congelés dans l’azote liquide 1 h après circulation des sondes CPH. Souris peuvent être traitées simultanément avec des antioxydants spécifiques pour différencier les espèces responsables par le signal. Figure 7 a montre le CP supérieure. signal chez les souris traitées Bleo par rapport aux souris témoins. Des spectres représentatifs du tissu pulmonaire de contrôle et de souris traitées Bleo sont indiquées dans la Figure 7 b. Spectres RPE un mixte de CP. et radical de l’acide ascorbique a été observée. Les valeurs indiquées dans la Figure 7 a sont les concentrations de CP. composants. Données ont été recueillies à la droite à l’aide de la cellule du tissu.
Figure 1 : détection de superoxyde dans les compartiments cellulaires différentes. (A) les spectres de RPE générés par 0,25 mM CMH de 0,5 mM l’hypoxanthine/xanthine oxydase (8 mU/mL) avec ou sans SOD (30 U/mL). (B) RAW 264.7 cellules (1 x 106 cellules/puits) ont été stimulées avec 10 µM PMA en présence de CMH pour 50 min à 37 ° C et nitroxyde concentration (µM) détectés en suspension de cellules (cellules + tampon) et tampon prélevés dans les cellules traitées. (C) RAW 264.7 cellules sont stimulées avec AGP vs. contrôle du véhicule (Con). Un ensemble de cellules ont été prétraités pendant 10 min avec SOD de cellule-imperméable de U/mL 30 (PMA + SOD). Chaque couleur représente les données de différents jours expérimentales, et chaque point représente les cellules d’un individu bien. Le signal de nitroxyde dans un blanc apparié dans le temps avec CMH dans KHB a été soustraite de chaque signal pour obtenir les valeurs finales. (D) calcul du superoxyde total et extracellulaire à la PMA stimule les cellules ; T = total superoxyde, EC = extracellulaire superoxyde (signal d’être inhibée par SOD). (E) pour évaluer le signal intracellulaire superoxyde (IC), le signal dans un tampon après PMA + SOD a été comparé aux cellules traitées PMA après l’enlèvement du tampon. Pour confirmer, les puits sont pré-traitées avec 60 U/mL perméable à la cellule PEG-SOD pour 1,5 heures pour déterminer la SOD intracellulaire être inhibée par. Le blank CMH apparié dans le temps est montré, et données reflètent absolute nitroxydes signal. Données exprimées en moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : détection de superoxyde mitochondriale en cellules stimulées avec l’antimycine A. (A) les spectres représentatifs de la rotation EPR mitochondrial spécifique probe, 0,25 mM mito-TEMPO-H en 264.7 cellules crues sans (Con) ou avec 25 µM l’antimycine A (AA) pendant 50 min à 37 ° C. B concentration de CM. (µM) dans les cellules traitées avec AA par rapport au témoin. Le signal de nitroxyde dans un blanc de mito-TEMPO-H apparié dans le temps a été soustraite de signal total pour obtenir les valeurs finales. Données exprimées en moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : détection de superoxyde dans RAW 264.7 cellules à 77K. (A) RAW 264.7 cellules stimulées avec 10 µM EGR et sonde de spin EPR, CMH 0,25 mM (50 min à 37 ° C) avec (noir) ou sans prétraitement (rouge) avec 30 U/mL SOD. 100 µL de liquide surnageant a été chargé dans un 1 pouce en morceau de la longueur du tube PTFE, puis flash congelés dans l’azote liquide. Les bouchons ont été retirés, et congelé tube PTFE a été placé dans le doigt dewar d’acquisition de données à 77 photo de K. (B) un tube PTFE et bouchons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : mesures EPR dans le sang et BALF chez les souris traitées à la bléomycine et du contrôle. Souris ont été traitées avec une dose unique de bléomycine intratrachéale (IT Bleo) (100 µL à 1 U/mL) ou véhicule de PBS. À 7 jours, les souris ont été anesthésiés et euthanasiés. Sang a été recueillies via ventriculaire droite ponction dans une seringue recouverte de 1000 héparine USP/mL contenant 100 µM DTPA. Lavage bronchoalvéolaire (LBA) a été recueilli par lavaging les poumons avec 1 mL de 100µm DTPA dans du PBS. Sang et BALF ont été incubés pendant 10 ou 50 min, respectivement, avec 0,2 mM CMH à 37 ° C. 150 µL de sang ou de BALF a été chargé en flash d’un tube PTFE congelé dans l’azote liquide et des EPR données recueillies à 77 K en utilisant un doigt dewar. Les données montrent des concentrations de nitroxyde dans le sang (A) et (B) BALF de PBS et Bleo-souris (n = 4-6). Données exprimées en moyenne ± SEM. (C) Representative spectres de nitroxyde dans le sang de souris traités Bleo et PBS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : mesures d’EPR dans les tissus pulmonaires congelés flash. Souris ont été traitées avec une dose unique de bléomycine intratrachéale (IT bleo) (100 µL à 1 U/mL) ou véhicule de PBS. À 7 jours, les poumons ont été rincées avec PBS froid pour enlever le sang et flash congelés dans l’azote liquide. 5-15 mg de tissu pulmonaire éclair gelé a été incubé avec 0,2 mM CMH dans KHB contenant 100 µM dans 200 µL de volume total pendant 1 h à 37° C. surnageant a été recueilli et placé dans un tube PTFE et courir à 77 K dans le doigt dewar. (A) nitroxyde concentration (µM de nitroxyde normalisé à 1 mg de tissu). Les données représentent la moyenne de 2-3 mesures pour chaque poumon. Données exprimées en moyenne ± spectres représentatifs SEM. (B) de nitroxyde dans les tissus pulmonaires chez des souris traités Bleo et PBS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : mesures d’EPR dans les tissus pulmonaires conservé dans un tampon saccharose. Des souris ont été traitées avec une dose unique de bléomycine intratrachéale (100 µL à 1 U/mL). À 7 jours après le traitement, les poumons ont été rincées avec du PBS froid pour enlever le sang et les tissus pulmonaires fraîches a été homogénéisé dans un tampon Tris-EDTA contenant du saccharose de 0,25 mM à un ratio de 1:6 poumon poids/tampon volume (mg/µL). 50 µL de l’homogénat de poumon était préincubés avec KHB avec ou sans les inhibiteurs suivants pendant 20 min à 37 ° c : SOD (100 U/mL), déféroxamine (MPO ; 800 µM) et le chlorure de diphényliodonium (DIP ; 100 μM) suivie d’une incubation avec 0,2 mM CMH dans KHB contenant 100 µM DTPA pendant 20 min à 37 ° C. Données ont été obtenues à la droite à l’aide de tubes capillaires EPR. (A) nitroxyde concentration dans les poumons des souris traités Bleo et PBS. (B) nitroxyde concentration Bleo poumons en l’absence ou la présence d’inhibiteurs (n = 3). Données exprimées en moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : mesures d’EPR dans les tissus pulmonaires chez des souris injectées avec sonde essorage CPH. 100 µL de CPH a été administrée via retroorbital injection pour une concentration finale de 20 mg de CPH par kg de poids corporel. Après 1 h de circulation, souris ont été euthanasiés, poumons ont été rincées avec 10 mL de froid PBS via le ventricule droit et du tissu pulmonaire était flash congelés. 20 à 30 mg de tissu pulmonaire a été placé en cellule de tissus et de mesures de l’EPR réalisées à température ambiante. (A) données exprimées en tours / mg. spectres (B) représentatifs de nitroxyde signalent dans les tissus pulmonaires de PBS et Bleo (* indique le chevauchement avec l’acide ascorbique radical). Données exprimées en moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Inhibiteurs de la | Espèces |
Superoxyde dismutase (SOD) | Extracellulaire superoxyde |
Superoxyde dismutase – polyéthylène glycol (PEG-SOD) | Superoxyde intracellulaire |
Catalase | Base de peroxyde d’hydrogène radicaux |
Urate | Peroxynitrate |
L’éthanol et le DMSO | Radical hydroxyle |
Chélateurs de métaux | Ions métalliques (fer et cuivre) |
Le tableau 1. Inhibiteurs communs utilisés pour distinguer les espèces responsables de l’oxydation de sonde de spin.
L’évaluation de la production de radicaux libres dans les milieux biologiques est importante redox compréhension réglementés de signalisation de santé et la maladie, mais la mesure de ces espèces est très difficile en raison de la courte demi-vie des radicaux libres et technique limites avec les méthodes couramment utilisées. RPE est un outil précieux et puissant en biologie de l’oxydo-réduction, comme c’est la méthode seulement sans ambiguïté pour la détection des radicaux libres. Dans ce projet, nous démontrons des méthodes pratiques d’EPR pour la conception d’expériences et de préparation des échantillons pour détecter des sondes ROS à l’aide de spin dans les différents compartiments cellulaires in vitro et tissus différents compartiments in vivo. Nous fournissons également des méthodes pratiques pour gérer les échantillons biologiques et de conserver les échantillons pour améliorer l’efficacité.
Sondes de spin réagissent efficacement avec ROS et produisent un radical nitroxyde stable qui peut être détectée avec l’EPR. Plusieurs dérivés de la sonde de spin (cyclique hydroxylamine) ont été synthétisés avec caractéristiques de perméabilité différente, ce qui les rend appropriés pour détecter la production de radicaux libres dans les différents compartiments cellulaires10. Ce protocole utilise la sonde essorage perméable à la cellule, CMH ; Cependant, le chlorure de 1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium de sonde de spin imperméable HCl (CAT1H) peut être utilisé pour détecter le superoxyde extracellulaire. Semblable à notre étude préalable lymphoblastique humain cellules lignes18, nous avons pu valider l’utilisation de la sonde de spin CMH perméable avec SOD imperméable et perméable PEG-SOD dans les cellules RAW264.7 (une lignée de cellules de le macrophage de poumon souris) stimulées avec de la PMA à des cellules la différence entre superoxyde extracellulaire et intracellulaire.
Nous avons également validé l’équilibration rapide de CMH entre les compartiments intra - et extra-cellulaires, et nous avons également constaté que le signal de superoxyde dans cellules gouttes significativement après lavage les cellules en une seule fois avec KHB (données non présentées). Nous avons confirmé l’utilité de la sonde mitochondrial spécifique spin mito-TEMPO-H en 264.7 cellules crues pour mesurer le superoxyde mitochondriale accrue générée lors de la stimulation avec inhibiteur de chaîne mitochondriale de transport d’électrons l’antimycine A. L’apport spécifique de la production de superoxyde mitochondriale au TEMPO-mito-H a été démontrée précédemment et peut être validée dans des expériences utilisant des systèmes ou des mitochondries isolées de frais avec la superoxyde dismutase mitochondriale MnSOD (SOD2) surexpression10.
L’évaluation de ROS production in vivo est particulièrement difficile, mais la capacité à détecter la production de ROS spécifique fournit d’importants renseignements lorsque interroger le rôle du stress oxydatif ou redox réglementée signalisation biologique Paramètres. La gestion appropriée des tissus lors de l’utilisation de spin les sondes et les EPR est essentiel pour produire des résultats significatifs et reproductibles. L’utilisation de sondes de spin avec le tissu ne sera pas radicaux superoxydes mesure susceptible de se présentent au moment de la récolte de tissus en raison d’une demi-vie courte, mais au contraire il détecte superoxyde produite par les enzymes telles que l’oxydase de NADPH, dételle monoxyde d’azote synthase endothéliale , ou de xanthine oxydase lorsque les tissus pulmonaires ou homogénats sont incubées avec la sonde de spin à 37 ° C. L’utilisation de tissus congelés n’inclura pas superoxyde généré par les mitochondries, depuis le gel activité dommages-intérêts de la chaîne mitochondriale de transport d’électrons. Pour tester le superoxyde mitochondriale, enquêteurs besoin d’isolat mitochondries fraîches ou utilisation des sondes spécifiques mitochondriale en vivo ou dans les tissus frais.
Plusieurs protocoles différents afin de préserver les tissus ont été publiés dans la littérature14,15. Nous avons comparé trois méthodes publiées pour les mesures de l’EPR dans les tissus pulmonaires : flash 1) tissu de congélation dans l’azote liquide et 3) traitement de souris in vivo avec un spin 2) homogénéisation des tissus dans un tampon saccharose sonde 1 heure avant la récolte de tissus. Nous avons comparé les souris témoins à des souris avec une inflammation pulmonaire grave et stress oxydatif induit par la bléomycine pour tester la capacité de chaque méthode pour montrer les différences cohérentes en signaux nitroxyde dans poumons blessés. Les trois méthodes ont montré une augmentation relative similaire nitroxyde signal dans les poumons des souris traitées à la bléomycine. L’utilisation de tissus congelés flash serait probablement la meilleure approche pour recueillir des tissus destinés à la plupart des laboratoires, niant la nécessité de traiter les tissus dans la mémoire tampon saccharose au moment de la récolte. L’injection de CPH à capturer des radicaux libres en vivo est puissante, mais pour confirmer ces espèces particulières, pour cela, un groupe de traitement, y compris l’antioxydant approprié.
Un des défis de l’utilisation de sondes de spin, c’est que l’oxydation des sondes de spin pour nitroxyde génère un spectre de RPE trois lignes similaire quelle que soit l’espèce responsable de l’oxydation ; ainsi, il ne distingue pas entre les différentes espèces ROS. En outre, on a signalé qu’il y a des réactions possibles des sondes de l’hydroxylamine avec transport d’électrons photosynthétiques chaîne et cytochrome c oxydase19,20. Ces observations devraient considérer lors de l’interprétation des résultats. Dans ce protocole, le système photosynthétique n’est pas présent, et l’inclusion de DTPA avec le tampon inhibe la contamination potentielle des ions ferreux et cuivreux libres10 . Nous avons montré comment utiliser une série d’enzymes spécifiques ou des chélateurs dans les tissus pulmonaires pour établir la contribution de ROS particulière ou inhibiteurs de l’enzyme pour déterminer l’origine de ROS. Cette approche a été précédemment utilisée RPE pour déterminer la contribution de ROS par eNOS dételé13,15. Nous fournissons une liste des inhibiteurs communs utilisé pour distinguer les espèces responsables de l’oxydation de sonde de spin (tableau 1).
Nous avons aussi démontré l’importance d’optimiser le temps d’incubation pour chaque condition expérimentale. Lorsque comparant spin sondes pour filer des pièges, pièges à spin génèrent un spectre unique selon le réactif qui permet pour la spécificité de l’espèce radicalaire ; Cependant, ils présentent cinétique lente pour superoxyde spin trapping et sont sujettes à la biodégradation. Le traitement du tissu pulmonaire avec l’EPR sonde ex vivo est également limité par l’incapacité de bien distinguer extracellulaire de superoxyde intracellulaire dû à la rupture des membranes cellulaires au cours du traitement du tissu (gel ou l’homogénéisation). Utilisation du spin injecté sonde in vivo avec SOD ou perméable à la cellule PEG-SOD peut résoudre ce problème.
Un seul but était d’établir un protocole pour efficacement prélever des échantillons et les stocker à-80 ° C avant les mesures de l’EPR. Nous avons donc mis au point une méthode pratique pour utiliser des tubes PTFE pour tenir les échantillons. Ce tube est placé directement dans le doigt dewar pour l’analyse des EPR à 77 K sans avoir à nettoyer le dewar entre les échantillons. Il s’agit d’une alternative à la méthode récemment publiée portant sur le gel des échantillons dans des seringues de 1 mL. Mesurées dans des échantillons congelés, stockés dans un tube PTFE peuvent être répétées sur plusieurs jours pour démontrer la stabilité du signal. Cette approche permet le traitement par lots les mensurations de l’EPR et facilite le transfert des échantillons entre laboratoires pour une installation distante de EPR peut exécuter les exemples.
Dans l’ensemble, ces protocoles prévoient une approche simple pour la préparation des cellules et des tissus pour les mesures de l’EPR dans les systèmes biologiques. Les protocoles peuvent être adaptées à d’autres modèles associée au stress oxydatif et l’utilisation d’autres sondes de spin. Le calendrier et la concentration de la sonde de spin devra être ajustée pour chaque condition expérimentale. La capacité de l’EPR pour déterminer la présence et la production de radicaux libres sans ambiguïté offre rigueur à des approches expérimentales dans le domaine de la biologie de l’oxydo-réduction.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par la faculté de l’Université du Colorado de médecine Dean award de l’Infrastructure de recherche stratégique, R01 HL086680-09 et 1R35HL139726-01, à la bourse E.N.G. et UCD CFReT (HE). Les auteurs remercient Dr Sandra Eaton et Dr. Gareth Eaton (Université de Denver), Dr Gerald Rosen et Dr. Joseph P. Kao (Université du Maryland) et Dr Sujatha Venkataraman (Université du Colorado, Denver) pour des discussions utiles et Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie et Ivy McDermott (Université du Colorado, Denver) pour le support technique.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
Critoseal | Leica | 39215003 | |
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID | NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon