Method Article
This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
L'oxyde nitrique (NO •) est un petit radical, qui médie plusieurs fonctions cellulaires importantes chez les mammifères, les bactéries et les plantes. Malgré l'existence d'un grand nombre de méthodes de détection de NO • in vivo et in vitro, la surveillance en temps réel de NO • au niveau d'une seule cellule est très difficile. Les effets physiologiques ou pathologiques de NO • est déterminée par la concentration réelle et de temps de séjour de ce radical. Par conséquent, des procédés qui permettent la détection de cellules isolées de NO • est hautement souhaitable. Récemment, nous avons élargi la palette de NO • indicateurs en introduisant unique à base de protéine fluorescente génétiquement codée oxyde nitrique (NO) • sondes (de geNOps) qui répondent directement aux cellulaires NO • fluctuations et, par conséquent, répond à ce besoin. Ici, nous démontrons l'utilisation de geNOps pour évaluer intracellulaires NO • signaux en réponse à deux chimique différente NO • molécules -liberating. Nos résultats also confirmer que fraîchement préparée de 3- (2-hydroxy-1-méthyl-2-nitrosohydrazino) -N-méthyl-1-propanamine (NOC-7) a un potentiel beaucoup plus élevé pour évoquer des changements dans les niveaux intracellulaires NO • par rapport à la inorganique NO • nitroprussiate donneur de sodium (SNP). En outre, deux couleurs imagerie des cellules vivantes en utilisant les geNOps verts (G-GENOP) et l'indicateur chimique Ca 2+ Fura-2 a été réalisée pour visualiser la réglementation stricte de Ca 2+ dépendante NO • formation dans les cellules endothéliales simples. Ces expériences représentatives démontrent que geNOps sont des outils appropriés pour enquêter sur la génération en temps réel et la dégradation des unicellulaires NO • signaux dans divers montages expérimentaux.
Nous avons récemment développé une nouvelle classe de fluorescents NO • sondes codées génétiquement, appelé les geNOps 1. Ces capteurs sont constitués par un simple bâti, les bactéries dérivées, NO 2 • domaine de liaison, qui est conjugué à une protéine fluorescente distincte (FP) variante 3 (cyan, vert ou orange FP). NO • liaison au fer non hémique (II) Centre 4 dans les geNOps instantanément réduit l'intensité de fluorescence 1. Fait important, la fluorescence de geNOps récupère rapidement et complètement lorsque intracellulaires NO • Les niveaux diminuent 1. Par conséquent, geNOps permettent l'imagerie en temps réel de (sous-) cellulaires NO • fluctuations. Bien que NO • détection du mécanisme de geNOps restent peu claires à ce jour, ils se sont avérés être d'excellents NO • journalistes, et ont donc le pouvoir d'ouvrir une nouvelle ère de polychromie, quantitative NO • bioimaging avec de hautes résolutions spatiales et temporelles 1, 5. Autres disponibles fluorescents NO • sondes sont basées sur de petits composés chimiques, qui doivent être chargés dans les cellules, et sont modifiées de façon irréversible par NO • 6. Inconvénients supplémentaires de NO • petites fluorophores sensibles sont leur cytotoxicité potentiel et spécificité relativement faible ce qui rend difficile de les utiliser d'une manière fiable, analytique et concluante 7, 8, 9. Bien que l'utilisation efficace des sondes fluorescentes codées génétiquement nécessite des techniques de transfert de gènes efficaces, capteurs codés génétiquement à base de FP ont émergé comme des outils indispensables qui ont révolutionné notre compréhension du fonctionnement interne des cellules 10, 11. Avant le développement des geNOps simples à base de FP, un groupe Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) à base • capteur de NO, appelé NOA-1 12, a été construit. Sato et al. conçu cette sonde sophistiquée qui se compose de deux sous - unités du NO • -sensible guanylate cyclase soluble (CGT), les deux capteurs à base de FRET de conjugués de rapports guanosine monophosphate cyclique (GMPc) niveaux 12. Comme cette sonde répond aux cGMP, il détecte indirectement intracellulaires NO • fluctuations 12. Bien que NOA-1 répond à NO • élévations dans la gamme de nano-molaire, cet outil n'a pas été utilisé fréquemment jusqu'à présent, probablement en raison des limitations concernant la disponibilité et la praticabilité de ce capteur bipartites encombrant.
Fonctions polyvalentes de NO •, ayant un impact fondamental des processus biologiques ont été bien caractérisés 13, 14. De nombreuses études ont montré que le NO • Concentration dans les cellules et sous - domaines qui détermine le destin des cellules dans la santé et les maladies 14, 15, 16. Dans les mammifères, NO • est principalement générée par voie enzymatique dans divers types de cellules par le bien caractérisé l'oxyde nitrique synthase (NOS) famille 17. Jusqu'à présent, trois isoformes de NOS ont été décrits 18, 19, 20; ce sont les Ca 2+ / calmoduline-dépendante NOS endothéliale (eNOS ou NOS-3) 18 et la NOS neuronale (nNOS ou NOS-1) 19 et le Ca 2+ / calmoduline-indépendante constitutivement active NOS inductible (iNOS ou nos- 2) 20. En outre, l'existence de mitochondrial NSA (mtNOS) a également été suggéré 21. Cependant, mtNOS est considéré comme une variante d'épissage de la nNOS, et est donc non classé séparément comme une isoforme 21. Une autre isoforme, à l' exception de ceux des cellules de mammifères, est le soi-disant NOS bactérienne (bNOS), trouve principalement dans les bactéries gram-positives 22. La production enzymatique de NO • est fortement contrôlée et dépend de la disponibilité de plusieurs cofacteurs tels que le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), flavine adénine dinucléotide (FAD), la tétrahydrobioptérine (BH4), l' oxygène moléculaire et de la L-arginine 17. L'acide aminé L-arginine cationique est le substrat qui est converti en L-citrulline lors de la production NO • 17. En plus de la génération enzymatique hautement régulé de NO •, il a été postulé que le radical peut être réduit de façon non enzymatique à partir de pools de nitrite par les mitochondries dans des conditions hypoxiques 23. • Une fois que NO est produit à l' intérieur d' une cellule, il peut diffuser librement à travers les membranes biologiques 14,ref "> 15. Cependant, la demi-vie très courte de ce radical est principalement déterminée par les conditions environnementales et différentes voies et les réactions chimiques se dégradent efficacement NO • niveaux 24. Finalement, la formation, la diffusion et la dégradation de NO • dépend les paramètres environnementaux variés qui déterminent la concentration efficace de la molécule biologiquement active hautement 24.
La technologie geNOps permet la détection directe de (sous) NO cellulaire • fluctuation 1 et est donc adapté à réexaminer, et récemment découvrir les mécanismes responsables de l'accumulation et la décomposition des cellulaires NO • signaux. Ici, nous fournissons des protocoles simples et des résultats représentatifs pour l'utilisation de geNOps pour visualiser de manière exogène évoquée et NO • profils générés de manière endogène, au niveau des cellules individuelles. En outre, la technologie de geNOps peut être adapté pour applicature dans d'autres systèmes de modèles de cellules pour étudier les motifs complexes de NO • la formation, la diffusion et à la dégradation en réponse aux stimuli cellulaires et des contraintes diverses.
1. Préparation de Tampons et solutions chimiques
2. Préparation des cellules
NOTE: En oRDONNANCE pour obtenir une uniformité des performances de la mesure de l' oxyde nitrique (NO •) dans des cellules individuelles à l' aide geNOps, les cellules doivent être pré-incubées avec un fer (II) / vitamine C , contenant un tampon avant les expériences d'imagerie afin de rétablir Fe 2+ dans le NO • domaine liant le du NO • -probes. Dans le cas des cellules EA.hy926 et HEK293, incubation pendant 20 minutes avec le fer (II) solution de rappel conduit à l'activation complète des NO • capteurs.
3. Imagerie de cellules vivantes NO • et Ca 2+ signaux dans les cellules individuelles
Analyse 4. Données
Visualisation des cellules uniques NO • Profils en réponse à transitoirement appliquée NO donateurs
Nous avons utilisé un clone de cellules HEK qui exprime de manière stable G-GENOP (figure 1A), afin de visualiser NO • signaux sur le niveau de la cellule unique en réponse à deux petits composés chimiques NO libérant différentes, CNP-7 et SNP. Les NO • donateurs ont été consécutivement appliqués et retirés à partir de cellules lors de l' imagerie à l' aide d' un système de perfusion par gravité qui a assuré flux continu (figure 1B). Toutes les cellules exprimant G-GENOP avec des intensités différentes ont montré une nette diminution de la fluorescence en réponse à la CNP-7 et SNP (figure 1C), indiquant rapide NO • accumulation dans les cellules lors de l'addition des NO • donateurs. Signaux de fluorescence normalisés (1-F / F 0) ont démontré que le NO • donateurs évoqués cellula homogèner NON • élévations qui a complètement récupéré après lavage des NO • composés -releasing (Figure 1D). Cependant, 10 uM de SNP induit seulement 50% du NO cellulaire • Signal (9,63 ± 1,05%, n = 3/38) qui a été atteint par 10 uM NOC-7 (18,10 ± 1,20%, n = 3/38, p < 0,0001). Afin d'atteindre l' égalité intracellulaires NO • niveaux avec le NO • donateurs, une concentration de 1 mM de SNP était nécessaire (Figures 1C, 1D).
Ensuite, nous avons testé la capacité fraîchement préparé par rapport a expiré NOC-7 pour élever intracellulaires NO • niveaux dans les cellules HEK. A cet effet, nous avons préparé quatre tampons expérimentaux contenant 5 uM NOC-7. Le NO • donneur a été soit ajouté fraîchement juste avant la mesure, ou maintenue dans les réservoirs pendant 1 h, 2 h et 3 h à la température ambiante avant la mesure. Les différents tampons ont été successivement appliqués à f éliminésROM , les cellules exprimant le G-GENOP en utilisant un système de perfusion (figure 2B). Cette approche a dévoilé la stabilité des aqueuses NOC-7 solutions qui, comme prévu, ont montré une diminution des capacités au fil du temps pour élever intracellulaires NO • niveaux (Figures 2A, 2C). Fait intéressant, NO • Les signaux récupérés nettement plus rapide lors de l'enlèvement des tampons expirés, par rapport à la intracellulaire NO • réponse qui a été évoquée par frais CNP-7 (figure 2C), l' adhérence indiquant peut - être des molécules intactes NO • -liberating à composants cellulaires .
Visualisation simultanée de Ca 2+ et NO • Les signaux dans les cellules endothéliales simples
Afin d'étudier Ca 2+ -triggered NO • formation dans les cellules endothéliales, l'endothéliales immortalisées cellules de remplacement couramment utilisé, la lignée cellulaire EA.hy926, était transiently transfectées avec G-GENOP et chargé avec Fura-2 / h (voir le protocole 2.8). La transfection a abouti à environ 10% des cellules endotheliales positives G GENOP (n = 6, la figure 3A), ce qui est suffisant pour enregistrer Ca2 + -evoked NON • la production au niveau des cellules endothéliales seules. Cependant, nous avons atteint près de 100% G-GENOP cellules EA.hy926 positives en utilisant un vecteur viral adéno-associé (n = 6; voir le protocole 2.2). Avant les mesures multi - canaux, les cellules ont été incubées pendant 20 min à température ambiante dans un tampon de stockage constitué par la L-NNA, un puissant inhibiteur irréversible NOS-26. Les cellules témoins ont été maintenus dans le même tampon de stockage sans L-NNA (voir Protocole 1.1) (figure 3B). Le traitement des cellules témoins avec l' histamine, un inositol 1,4,5-triphosphate puissant (IP 3) générant un agoniste, cytosolique instantanément élevée Ca2 + niveaux suivie d'une augmentation progressive du NO intracellulaire • jusqu'à ce que l'agoniste a été removed (figures 3C, 3D). Les cellules pré-traitées avec le NOS-inhibiteur montré cytosolique Ca 2+ signaux similaires, alors que le NO intracellulaire • niveau est resté à peu près inchangée en réponse à l' histamine (Figure 3E). EA.hy926 cellules exprimant G-GENOP ont également été traitées avec 1 uM et 100 uM de l'IP 3 générant agoniste ATP afin de tester si oui ou non geNOps conviennent de surveiller NO • signaux en réponse à la fois une faible physiologique et supra-physiologiques Les concentrations d'un agoniste (figure 3F). Dans la lignée cellulaire endothéliale 1 pM ATP évoqué un cytosolique clair NO • signal, qui était d' environ la moitié du signal obtenu par 100 pM ATP (Figure 3F).
Figure 1: profils de NO intracellulaires en réponse à différentes NO-liberati ng molécules. (A) images larges de cellules HEK de terrain exprimant de manière stable cytosolique G-GENOP. Barre d'échelle = 20 pm. (B) Représentation schématique d'un système de perfusion par gravité à base de semi-automatique pour l'application commandée et le retrait de la NOC-7 et le SNP. (C) représentatif (sur 3 expériences indépendantes) non normalisée d' intensité de fluorescence de cellules uniques traces en unités arbitraires en fonction du temps des cellules HEK exprimant de façon stable cytosolique G GENOP en réponse à 10 uM NOC-7, 10 uM de SNP, et 1 mM SNP. courbe gras noir représente la courbe moyenne de 26 traces unicellulaires (courbes gris clair). Courbe noire représente Parsemé F 0, qui a été utilisé pour la normalisation. (D) traces simples Normalisé et inversées (1-F / F 0, courbes gris clair), et courbe moyenne (courbe noire en gras) au fil du temps en réponse à 10 uM NOC-7, 10 uM SNP, et 1 mM SNP extrait de panneau C.es / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Essai de stabilité de la NOC-7 en utilisant des cellules HEK stable G-GENOP exprimant. (A) représentant NO • courbe de réponse de concentration dans le temps de manière stable G-GeNOps exprimant des cellules HEK lors de l' application de la NOC-7 solutions tampons fraîches et anciennes. Tous les tampons contenant de la CNP-7 ont été préparées d'abord avec une concentration finale de 5 uM en utilisant la même solution de stock (50 mM). Le temps écoulé des solutions respectives après la préparation jusqu'à ce que des quantités d'imagerie à 1 h, 2 h et 3 h comme indiqué. (B) Représentation schématique d'un système de perfusion de semi-automatique par gravité consécutivement ajouter et supprimer des solutions de la CNP-7 contenant lors de l' imagerie. (C) corrélations temporelles decellulaire NO • signaux en réponse fraîchement préparés et vieux CNP-7 tampons. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: imagerie multicanal simultanée de NO • et Ca 2+ signaux dans les cellules EA.hy926 simples. (A) représentatifs grand champ images de fluorescence des cellules exprimant EAhy.926 G-GENOP (panneau de gauche) qui sont chargés avec fura-2 / h (moyenne et panneaux de droite). Barre d'échelle = 20 pm. (B) Représentation schématique du traitement des cellules avec 500 uM EAhy.926 Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) pendant 20 minutes dans une plaque à six puits avant la mesure. (C) au cours du temps représentatif d'un enregistrement simultané de fura-2 (excitation: 340 nm / 380 nm emission: 510 nm) et des signaux G GENOP (excitation: 480 nm; émission: 520 nm) en réponse à 100 uM d'histamine. Comme indiqué histamine a été éliminé au bout de 3 min à l'aide d'un système de perfusion. (D) Les courbes représentent des enregistrements simultanés de cytosolique Ca 2+ (-2 fura signaux de rapport, F 340 / F 380 est gris ligne pleine) et NO • (courbe normalisée et inversée, 1-F / F 0 est une ligne solide vert) signaux au fil du temps d'une seule fura-2 / am chargé cellules endothéliales exprimant transitoirement G-GENOP. Les cellules ont été stimulées avec 100 uM d' histamine pendant 3 min dans un Ca2 + (2 mM CaCl2) contenant un tampon (n = 03/08). (E) représentant enregistré simultanément Ca 2+ (ligne solide gris) et NO • Les signaux (ligne verte solide) au fil du temps d'une cellule EA.hy926 qui a été prétraités avec 500 uM Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) avant à la mesure (n = 03/12). Les cellules ont été traitées avec 100 uM d'histamine en présence de 2 mMCa 2+. (F) représentant les courbes moyennes cytosoliques NO • Les signaux en réponse à 1 uM d' ATP suivie d'une seconde stimulation des cellules avec 100 pM d' ATP. Les barres représentent les valeurs moyennes ± écart-type des signaux G GENOP maximaux en réponse à 1 uM d'ATP (barre blanche) et 100 uM d'ATP (barre verte) de 4 expériences indépendantes; p <0,001 par rapport à 1 pM d'ATP. P-valeur a été calculée en utilisant un test t non apparié. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Depuis la découverte de NO • comme une molécule de signalisation importante dans la biologie 28, la mesure spécifique en temps réel du radical dans des cellules individuelles, des tissus et des animaux entiers avec une haute résolution d'une manière réaliste et fiable a été aspiré. Nous rapportons ici l'application de récemment mis au point génétiquement codés fluorescents NO • sondes (geNOps) qui permettent précisément l' imagerie des cellules vivantes de NO • signaux utilisant grand champ de microscopie par fluorescence 1.
Pour contourner les procédures de transfection élaborées et invasives clone de cellules HEK qui exprime de manière stable fluorescente verte G-GENOP a été utilisé pour quantifier une seule cellule générée de manière exogène NO • profils. Comme les cellules HEK normalement ne produisent pas de manière endogène • NO 29, ce type de cellule est apte à la génération d'une lignée de cellules de détection à base GENOP, ce qui pourrait être utile pour de nombreuses autres applications dans des conditions de co-cultureavec NO • produire des cellules primaires ou même chez les animaux 30 vivant. Toutefois, dans cette étude, nous démontrons la capacité de divers composés NO • -liberating, de différentes concentrations et stabilités, pour évoquer intracellulaires NO • signaux en utilisant le modèle de cellules HEK G-GENOP exprimant. Nos données ont révélé que le NO • donneur de concentration, la qualité et la méthode d'application éventuellement déterminer les motifs de NO intracellulaires • profils. Ces informations sont indispensables pour la pharmacocinétique in situ la caractérisation des différentes NO • donateurs, qui sont indicatifs de plusieurs maladies. Notamment, geNOps ont été montré pour répondre de manière stable à de multiples applications répétitives de NO • donneur de impulsions sur une très longue période 1. En conséquence, les expériences utilisant NO • -liberating composés présentés ici, permettent des conclusions semi-quantitatives sur les diverses amplitudes et la cinétique de NO cellulaire respective226; les signaux (figures 1 et 2).
Bien que le HEK exprimant de manière stable le clone cellulaire provient probablement d'une seule cellule, une grande hétérogénéité du G-geNOps les niveaux d'expression a été observée (figure 1). Ceci est une caractéristique commune des clones cellulaires stables comme la transcription du (génome intégré) gène d'intérêt est sous le contrôle de nombreux facteurs tels que divers stress environnementaux 31 qui influencent les taux de croissance des cellules 32 et l'état du cycle cellulaire 33. Les geNOps simples à base de FP sont des sondes non-ratiométrique et, par conséquent, le NO • perte induite par des augmentations d'intensité de fluorescence avec le niveau d'expression GENOP 1. En conséquence, la normalisation des signaux de geNOps est essentiel pour la quantification cellulaires NO • signaux particulièrement dans le cas d'une analyse comparative. Comme le montre notre étude récente, une stricte corrélation linéaire bntre l'intensité de fluorescence basale de geNOps et la force de l'extinction de la fluorescence induite par NO • sur une large gamme d'intensités de fluorescence a été trouvée 1. Ceci est une caractéristique importante de geNOps pour la quantification absolue des cellulaires NO • signaux. Comme le montre la figure 1, la normalisation des signaux G-geNOps en réponse à NDP-7 et SNP a révélé homogènes NO • signaux dans différentes cellules HEK de la même plaque, ce qui indique que les cellules HEK ne sont pas diversifiés quant à leur capacité à prendre et dégrader le radical NO • qui provient du NO • donneur. En revanche, à l'aide de geNOps dans les cellules HeLa ont démontré hétérogénéités claires de cellulaires NO • signaux entre différentes cellules en réponse à la CNP-7. Ces différences pointer spécifiques du type NO • métabolisme et décomposition des taux de cellules, ce qui pourrait avoir des implications multiples dans la physiologie cellulaire et la pathologie, et peut être découvert en utilisant la GENOPla technologie de l'art.
Néanmoins, deux caractéristiques importantes de geNOps doivent être soigneusement examiné pour l'utilisation correcte des capteurs et des interprétations de données: i) geNOps nécessitent suffisamment de fer (II) pour répondre pleinement aux NO • 1 et ii) en fonction de la variante FP, geNOps peut être sensible au pH 1. Nous décrivons ici un protocole qui a été jugé approprié pour la supplémentation en fer non toxique (II) de geNOps, qui sont exprimés dans les deux HEK, des cellules HeLa ou EA.hy926 (voir Protocole 2.6). Bien qu'il ait été démontré que le traitement des cellules avec du fer (II) / vitamine C n'a pas affecté la morphologie cellulaire, la viabilité cellulaire et l' activité métabolique des cellules 1, il peut être nécessaire d'optimiser cette étape importante pour d' autres types de cellules et tissus. Cependant, dans certaines conditions expérimentales, l'exigence de fer (II), le chargement peut limiter l'applicabilité de geNOps. Notamment, il a été démontré que l'ascorbate peut réduire le NO • 35 et ascorbate de fer (II) complexes sont capables de piéger NO • 36, 37. En outre, l' excès de fer (II) et l' ascorbate peuvent induire des réponses inflammatoires 39 et eNOS découpler 41. Ces effets doivent être pris en considération lors de l'utilisation de la technologie geNOps. Il a été démontré que , dans certaines conditions expérimentales, le pH intracellulaire est affecté de manière significative 34, qui a le potentiel d'influencer la fluorescence geNOps 1. Notamment, les variantes de cyan et geNOps verts sont relativement sensibles au pH montrant une diminution de la fluorescence lors de l' acidification 1. Par conséquent, des changements aigus de la (sous) pH cellulaire peuvent simuler de faux NO • signaux lorsque vous utilisez les geNOps sensibles au pH. Comme suggéré dans nos travaux précédents, l'utilisation parallèle de NO • geNOps insensibles (geNOps mut) en tant contro négativels est recommandé de disséquer réelle cellulaire NO • signal du pH change 1. En plus des changements de pH cellulaire peuvent être inspectés en utilisant des sondes de pH tels que Sypher 34.
En outre, nous avons visualisé enzymatique NO endogène • la formation en réponse à un agoniste physiologique Ca2 + dans la cellule mobilisant l' endothelial porteuse EA.hy926. La lignée cellulaire EA.hy926 est un système modèle fréquemment utilisé exprimant constamment eNOS 38. Utilisation de geNOps transitoirement exprimés dans les cellules EA.hy926, a confirmé que IP 3 médiée les signaux de Ca évoquent profonde NO • formation dans ce type de cellule, qui a été presque complètement bloquée par L-NNA. Afin de corréler temporellement Ca 2+ avec NO • Les signaux, les cellules G-GENOP exprimant ont été chargées avec la excitables-UV chimique Ca 2+ -Indicateur fura-2 / h. La séparation spectrale du Ca 2+ lié et non lié fura-2 Fluo rescence du signal G GENOP peut être facilement réalisé avec des jeux de filtres disponibles dans le commerce 40. Imagerie les deux sondes ont dévoilé que le Ca 2+ enzymatique -triggered NO • formation se produit beaucoup plus lent par rapport à la hausse du cytosolique Ca dans ce type de cellules endothéliales. Cinétiques similaires de unicellulaires NO • signaux dans les cellules endothéliales de l' artère pulmonaire bovine sur le traitement des cellules avec l'agoniste bradykinine IP 3, générant ainsi que les contraintes de cisaillement ont été rapportés en utilisant NOA-1, un capteur très NO • -sensible indirecte 12 . Par conséquent, ces données soulignent que le Ca2 + -evoked eNOS dérivé NON • la formation nécessite un certain temps de démarrage jusqu'à ce que l'activité enzymatique totale est atteinte. Bien que la cinétique cellulaire NON • la formation, la diffusion et la dégradation peuvent être extraites à partir d' autres données, par exemple sur la base des mesures de tensions de NO • induite par la relaxation des vaisseauxss = "xref"> 26, le grand avantage de NO fluorescentes • sondes est qu'ils convertissent directement cellulaires NO • fluctuations en signaux visibles en temps réel. Par conséquent, l'imagerie cellulaire NO • signaux avec geNOps fournit une résolution spatiale et temporelle, et offre des possibilités uniques en (re) enquêter sur le (sous) cellulaire NO • homéostasie. Par exemple, l' imagerie eNOS la navette 42 en combinaison avec la technologie de geNOps dans les cellules endothéliales unique peut être adapté pour établir une corrélation entre la formation de NO • la localisation subcellulaire et la translocation de l'enzyme NO • productrices ou d' autres protéines appropriées telles que la calmoduline et 43 cavéoline.
Nous décrivons ici l'application possible du G-GENOP exprimant des cellules HEK et EA.hy926 de visualiser de manière exogène et endogène généré cellulaires NO • signaux sur le niveau d'une seule cellule et en temps réel sur une large fluorescence de champ m classiqueicroscope. Nos données impliquent que geNOps sont appropriés pour suivre spécifiquement (sous-) cellulaires NO • Dynamique dans diverses conditions expérimentales en utilisant toutes sortes de types de cellules intéressantes.
EE, MW, RM et WFG, les membres de l'Université médicale de Graz du personnel, ont déposé une demande au Royaume-Uni en matière de brevets (numéro de demande de brevet WO2015EP74877 20151027, numéro de priorité GB20140019073 20141027) qui décrivent les parties de la recherche dans ce manuscrit. Licences relatives à ce brevet sont fournies pour la prochaine génération d' imagerie par fluorescence (NGFI) GmbH ( http://www.ngfi.eu/ ), une société spin-off de l'Université médicale de Graz.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2·6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4·2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; with 1,000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100x) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50x) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50x the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30 mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30 mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | 40X objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |
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