Nuestro objetivo es aislar subgrupos específicos de UC-MSCs humanas y analizar sus características básicas de acuerdo con sus factores transcriptómicos unicelulares. Estamos tratando de responder cuáles son los caracteres y funciones distintos para las diferentes subpoblaciones de UC-MSC. Los desarrollos más recientes en nuestro campo son el descubrimiento de la heterogeneidad de poblaciones mixtas de MSC, principalmente mediante el uso de secuenciación de ARN unicelular.
Identificamos las tres subpoblaciones dentro de las UC-MSC humanas, incluidas las células BAMBI altas MFGE8. Este subgrupo exhibe un fenotipo distinto, un perfil transcriptómico único, un potencial adipogénico limitado y una actividad inmunosupresora reducida en la nefritis lúpica. Estos hallazgos avanzan en la comprensión de las UC-MSC y respaldan la selección de subgrupos óptimos para el tratamiento de enfermedades específicas.
Estamos allanando el camino para comprender las funciones reales no solo de las BAMBI con alto MFGE8 y las UC-MSC altas, sino también de los otros dos subgrupos, especialmente sus roles en el tratamiento de diferentes enfermedades. Continuaremos enfocándonos en iniciar aplicaciones de subgrupos humanos de UC-MSC en múltiples enfermedades inmunomediadas y explorar sus mecanismos moleculares en el tratamiento de esas enfermedades. Para aislar BAMBI alto MFGE8 alto UC-MSCs, cultive UC-MSC a una densidad de aproximadamente 5 a 10 veces 10 a la potencia de 6 células en DMEM completo.
Añadir 0,5 milimolares de EDTA durante cinco minutos para disociar las células. A continuación, añade el DMEM completo y transfiere la suspensión de la célula a un tubo cónico de 15 mililitros. Pipetea la suspensión de celdas hacia arriba y hacia abajo varias veces para preparar una suspensión de una sola celda.
Toma 10 microlitros de la suspensión celular. Cuente las células con un hemocitómetro y calcule el número total de células recolectadas. Después de contar, centrifugar el número requerido de celdas a 300 G durante cinco minutos.
Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio completo para lograr una concentración de 5 a 10 veces 10 a la potencia de 6 celdas por mililitro, y coloque el tubo en hielo. A continuación, divida las células recolectadas en cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue los anticuerpos primarios en una dilución de 1 a 100 a los tubos MFGE8 y BAMBI.
Mezcle bien el contenido e incube las células a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, agregue PBS para lavar las células marcadas. Centrifugar los tubos a 300 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en un mililitro de medio completo.
Añada los anticuerpos secundarios fluorescentes conjugados en una dilución de 1 a 1.000 a las células resuspendidas. Mezcle bien e incube los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante cuatro 15 minutos. Después de la incubación, agregue PBS y centrifugar para lavar las celdas marcadas.
Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de medio completo y fíltrelos a través de un colador de celdas de 70 micrómetros para eliminar grumos y residuos. Transfiera el filtrado a un tubo de 15 mililitros para la clasificación por citometría de flujo. Ejecute el tubo de células en blanco como un control negativo sin agregar un anticuerpo.
Ajuste la configuración de dispersión directa y dispersión lateral en el citómetro de flujo para establecer la escala de compuerta para la población no teñida. A continuación, ejecute el MFGE8 y el BAMBI marcados con un solo anticuerpo como control de compuerta para determinar dónde comienza la positividad en la gráfica. Ejecute los tubos de muestra experimentales para clasificar la alta población de células BAMBI MFEG8 y recoja las células clasificadas.
Coloque las MSC clasificadas en una placa de 24 pocillos e incube las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Una vez que las células clasificadas hayan crecido a través de dos pasajes, realice un análisis de citometría de flujo para confirmar la pureza de la población clasificada. Las UC-MSC cultivadas fueron fuertemente positivas para la expresión de CD44, CD73, CD90 y CD105, y negativas para la expresión de CD14, CD34, CD45, CD79 y HLA DR.
Las MSC altas de MFEG8 con alto contenido de BAMBI se separaron de las UC-MSC humanas cultivadas, y se confirmó que sus niveles elevados de expresión de BAMBI y MFEG8 persistían a través de tres o cuatro pasajes. La frecuencia de MSCs con alto contenido de MFEG8 varió según el donante y el método de disociación.
