Este protocolo proporciona una manera sencilla y rentable de aislar los ASC sin el uso de enzimas duras o pasos de centrifugación, que pueden alterar el fenotipo celular y el comportamiento. La falta de pasos duros produce menos células manipuladas que las aisladas con enzimas y centrifugación, minimizando las preguntas sobre si las observaciones experimentales son un artefacto del método de aislamiento. Este método de explant puede generar ASCs clínicamente relevantes para ser introducido en un paciente para tratar una variedad de enfermedades o expandirse en la vida permitir aplicaciones de investigación.
Es difícil explicar completamente el método de picado en palabras. La demostración visual puede servir a otros científicos las molestias de aprender a romper el tejido ellos mismos. Métodos de explant similares se pueden utilizar para aislar otras poblaciones de MSC, como las de los tejidos umbilicales.
Para picar las muestras de tejido de abdominoplastia, primero transfiera el tejido a la tapa de una placa estéril de 100 milímetros. Luego usa una aguja estéril para sostener un pedazo de tejido en su lugar y usa un bisturí estéril para cortar el tejido en trozos de menos de un milímetro. Transfiera el tejido a un tubo fresco e invierta o agite la muestra de cinco a seis veces para asegurar la mezcla de todas las capas.
Luego, con una espátula estéril, transfiera de 2,5 a cinco mililitros de tejido a una placa de cultivo de tejido tratado con plasma de gas al vacío de 100 milímetros. Mida el volumen de la muestra vertiendo en un tubo de centrífuga fresco. A continuación, agregue un volumen equivalente de medios de cultivo de tejido a la placa y gire suavemente la placa para mezclar el contenido.
Incubar la placa a 37 grados celsius en cinco por ciento de dióxido de carbono hasta que se vea un número suficiente de células en la base de la placa. Una vez que se observa un número suficiente de células en la placa o después de siete días, lo que sea antes, retire todos los trozos restantes de tejido. A continuación, el cultivo de los ASC en medios de cultivo de tejidos hasta que alcancen el 70% de confluencia o hasta que los racimos se densan en qué momento se deben pasar las células.
Enjuague suavemente la placa con 1X de solución salina tamponada de fosfato. Para probar las células adherentes, aspirar la solución salina tamponada de fosfato, añadir un mililitro de tripsina complementada con 0,25% EDTA a cada plato e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Agregue una pequeña cantidad de medios a la placa para desactivar la tripina.
A continuación, pipetee suavemente la tripína media desde la parte superior de la placa hacia abajo, soltando las células débilmente unidas de la placa. Para sembrar las celdas, primero agregue medios a la placa. Luego, agregue las celdas de una manera gota y luego gire la placa para asegurar una distribución uniforme a través de la placa.
Después de tres pasajes, proceda a fluir los ensayos de citometría y diferenciación. Después de tres pasajes, se encontró que los ASC aislados de lipoaspirato y abdominoplastia tenían una morfología y fenotipo de MSC, similar a los ASC aislados después de una digestión enzimática. Al igual que otros MSC, los ASC aislados explant son negativos para CD45 y positivos para CD73, CD90 y CD105.
Al picar el tejido, el área superficial de cada pieza debe ser lo suficientemente grande para que los ASC migren fuera del tejido. Estas son células madre fundamentales que se pueden utilizar para una amplia gama de aplicaciones. Los ASC aislados se pueden utilizar para cualquier aplicación posterior, in vivo o in vitro.
