Presentamos un protocolo sencillo para visualizar glicoconjugados sialilados intracelulares con alta resolución espacial, eliminando la necesidad de equipos especializados. Este método facilita el estudio de la biosíntesis, el tráfico y el reciclaje en diversos contextos patológicos. Para lograr esto, combinamos el marcaje metabólico, la química de clic y la microscopía de expansión.
Las técnicas de microscopía de superresolución como STED y STORM permiten a los científicos superar la barrera de difracción, pero requieren equipos costosos. Recientemente, el microscopio de expansión ha surgido como una alternativa más accesible que mejora la resolución al ampliar físicamente la muestra. Este método se puede utilizar con cualquier microscopio de recursos completos de rutina.
No requiere microscopios de súper resolución, que son costosos, requieren mucho tiempo, son de difícil acceso y requieren una amplia optimización. Por lo tanto, este método es fácilmente transferible a la mayoría de los laboratorios. Para comenzar, agregue un mililitro de medio suplementado con 500 micromolares de N-azidoacetilmannosamina a las células preparadas e incube durante 24 horas a 37 grados Celsius bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5%.
Luego, lave las muestras con un mililitro de PBS. Usando 500 microlitros de paraformaldehído al 5%, fije las celdas en cada cubreobjetos y déjelas reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, prepare una cámara húmeda personalizada con una caja opaca con tapa.
Coloque un pedazo de papel secante húmedo en la parte inferior, luego coloque una capa de parafilm encima. Coloque los cubreobjetos en el parafilm con las celdas hacia arriba. Para la permeabilización celular, agregue 200 microlitros de Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Luego, lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS. Prepare un tampón de reacción de CuAAC para marcar los glicanos sialilados modificados con azida diseñados con los componentes dados. Para iniciar la reacción, agregue 200 microlitros de tampón CuAAC a cada cubreobjetos y cubra bien la muestra.
A continuación, lave las cubrebocas tres veces con 200 microlitros de PBS para detener la reacción y eliminar el exceso de sonda y reactivos. Incubar las muestras durante una hora a cuatro grados centígrados en 200 microlitros de tampón de bloqueo BSA. Añadir 70 microlitros de la solución que contiene el anticuerpo primario a los cubreobjetos e incubar durante una hora a cuatro grados centígrados, protegido de la luz.
A continuación, se añaden 100 microlitros del anticuerpo secundario fluorescente a cada cubreobjetos y se incuba durante una hora a temperatura ambiente protegidos de la luz. Después de lavar los cubreobjetos tres veces con PBS, transfiera los cubreobjetos a una placa de seis pocillos y almacene las muestras en dos mililitros de PBS a cuatro grados centígrados durante unos días protegidos de la luz. Para empezar, incubar las células inmunotintoradas con n-Acriloilsuccinimida a una concentración de 3,2 miligramos por mililitro en PBS en un agitador mecánico durante una hora a temperatura ambiente.
Luego, lave las muestras tres veces con un mililitro de PBS. Ahora, coloque una gota de 70 microlitros de solución de monómero en un trozo de parafilm. Agregue 1,4 microlitros de 10% N, N, N'N'n'Tetrametiletilendiamina y persulfato de amonio al 10%, luego mezcle con la gota.
Coloque rápidamente el cubreobjetos sobre la solución con las celdas hacia abajo. Deje que la solución se polimerice durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. A continuación, agregue un mililitro de tampón de digestión al hidrogel y deje que la digestión continúe durante tres horas a 37 grados centígrados en un agitador mecánico.
Después de quitar el tampón de digestión, lave el gel tres veces con dos mililitros de agua desionizada. Ahora, deja que el hidrogel se expanda en tres mililitros de agua desionizada durante dos horas, cambiando el agua cada 30 minutos. Para comenzar, encienda el microscopio y asegúrese de que las fuentes de luz se calienten.
A continuación, abra el software de adquisición de bioimágenes. Para crear los canales, seleccione las longitudes de onda de excitación del láser correspondientes a los fluoróforos y active los láseres en consecuencia. Seleccione una lente de objetivo adecuada, como un objetivo de inmersión en aceite de 63x con una apertura numérica de 1,4 o equivalente.
Ahora, coloque y asegure un cubreobjetos de 32 milímetros de diámetro en un soporte adaptado al microscopio. Coloque la muestra de células inmunotinción con las células hacia abajo en el cubreobjetos de 32 milímetros y agregue una gota de agua desionizada para evitar que la muestra se seque. A continuación, coloque el soporte con el cubreobjetos en la platina del microscopio por encima del objetivo.
Para obtener imágenes posteriores a la expansión, coloque hidrogel en el cubreobjetos y realice un escaneo de mosaicos. Utilice el modo de fluorescencia de campo claro o de baja intensidad láser para localizar un área de interés y enfocarla. A continuación, configure los parámetros de adquisición de la imagen, como la velocidad de escaneo, el número de promedio, la dirección, el modo de escaneo, el método y el tamaño del orificio para lograr la observación deseada.
Ahora, visualice las celdas en el software usando el modo de fluorescencia en vivo. Aumente gradualmente la potencia del láser y ajuste la ganancia y el desplazamiento del detector para amplificar la señal sin introducir ruido excesivo, lo que garantiza una visualización clara de la fluorescencia sin sobreexposición. Finalmente, realice la adquisición de la imagen y guarde los datos en el formato deseado, asegurándose de incluir los metadatos adecuados para futuras referencias.
Una vez completada la adquisición, agregue una pequeña cantidad de agua desionizada para facilitar la transferencia con pinzas y transfiera la muestra nuevamente a la placa de seis pocillos. El diámetro promedio del núcleo de Feret aumentó de 17,7 micrómetros antes de la expansión a 70,3 micrómetros después de la expansión, lo que indica un factor de expansión de cuatro. El patrón de marcado de fibroblastos antes de la microscopía de expansión mostró fluorescencia roja y verde prominente que indica detalles subcelulares en el aparato de Golgi, pero con resolución limitada, lo que impidió el análisis en la muerte.
Después de la microscopía de expansión, se observó una resolución espacial significativamente mejorada de las estructuras subcelulares con vesículas verdes y rojas más intrincadas visibles dentro de las células de fibroblastos.
