Wir präsentieren ein unkompliziertes Protokoll zur Visualisierung intrazellulärer sialylierter Glykokonjugate mit hoher räumlicher Auflösung, wodurch spezielle Geräte überflüssig werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Biosynthese, des Handels und des Recyclings in verschiedenen pathologischen Kontexten. Um dies zu erreichen, kombinieren wir metabolische Markierung, eine Klick-Chemie und Expansionsmikroskopie.
Superauflösende Mikroskopietechniken wie STED und STORM ermöglichen es Wissenschaftlern, die Beugungsbarriere zu überwinden, erfordern jedoch teure Geräte. In letzter Zeit hat sich das Expansionsmikroskop als zugänglichere Alternative herausgestellt, die die Auflösung durch physikalische Vergrößerung der Probe verbessert. Diese Methode kann mit allen routinemäßigen Vollressourcenmikroskopen verwendet werden.
Es werden keine hochauflösenden Mikroskope benötigt, die kostspielig, zeitaufwändig, schwer zugänglich und umfangreich optimiert sind. Daher ist diese Methode leicht auf die meisten Labore übertragbar. Zu Beginn fügen Sie den vorbereiteten Zellen einen Milliliter Medium hinzu, das mit 500 mikromolaren N-Azidoacetylmannosamine ergänzt ist, und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre.
Waschen Sie dann die Proben mit einem Milliliter PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 5%igem Paraformaldehyd auf jedem Deckglas und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Bereiten Sie als Nächstes eine benutzerdefinierte Feuchtkammer mit einer undurchsichtigen Schachtel mit Deckel vor.
Lege ein nasses Blatt Löschpapier auf den Boden und lege dann eine Schicht Parafilm darauf. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen nach oben auf den Parafilm. Für die Zellpermeabilisierung fügen Sie 200 Mikroliter 0,5% Triton X-100 in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur hinzu.
Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS. Bereiten Sie einen CuAAC-Reaktionspuffer vor, um die Azid-modifizierten sialylierten Glykane zu markieren, die unter Verwendung der angegebenen Komponenten hergestellt wurden. Um die Reaktion zu starten, fügen Sie 200 Mikroliter des CuAAC-Puffers zu jedem Deckglas hinzu und bedecken Sie die Probe gründlich.
Waschen Sie dann die Deckgläser dreimal mit 200 Mikrolitern PBS, um die Reaktion zu stoppen und überschüssige Sonden und Reagenzien zu entfernen. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in 200 Mikrolitern BSA-Blockierungspuffer. Geben Sie 70 Mikroliter der Lösung, die den Primärantikörper enthält, auf die Deckgläser und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius lichtgeschützt.
Geben Sie dann 100 Mikroliter des fluoreszierenden Sekundärantikörpers auf jedes Deckglas und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz inkubieren. Nachdem Sie die Deckgläser dreimal mit PBS gewaschen haben, übertragen Sie die Deckgläser auf eine Sechs-Well-Platte und lagern Sie die Proben in zwei Millilitern PBS bei vier Grad Celsius für einige Tage lichtgeschützt. Zu Beginn inkubieren Sie die Immunfärbezellen mit n-Acryloylsuccinimid in einer Konzentration von 3,2 Milligramm pro Milliliter in PBS auf einem mechanischen Schüttler für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Proben dann dreimal mit einem Milliliter PBS. Geben Sie nun einen 70-Mikroliter-Tropfen Monomerlösung auf ein Stück Parafilm. Fügen Sie 1,4 Mikroliter 10%N, N, N'N'Tetramethylethylendiamin und 10%Ammoniumpersulfat hinzu und mischen Sie sie dann in den Tropfen.
Legen Sie den Deckglas schnell mit den Zellen nach unten auf die Lösung. Lassen Sie die Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer polymerisieren. Geben Sie anschließend einen Milliliter Aufschlusspuffer in das Hydrogel und lassen Sie den Aufschluss drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf einem mechanischen Schüttler ablaufen.
Nach dem Entfernen des Verdauungspuffers waschen Sie das Gel dreimal mit zwei Millilitern entionisiertem Wasser. Lassen Sie nun das Hydrogel zwei Stunden lang in drei Millilitern entionisiertem Wasser expandieren und wechseln Sie das Wasser alle 30 Minuten. Schalten Sie zunächst das Mikroskop ein und stellen Sie sicher, dass die Lichtquellen aufgewärmt sind.
Öffnen Sie dann die Bioimaging Acquisition Software. Um die Kanäle zu erzeugen, wählen Sie die Laseranregungswellenlängen entsprechend den Fluorophoren aus und aktivieren Sie die Laser entsprechend. Wählen Sie ein geeignetes Objektiv aus, z. B. ein 63-faches Öl-Immersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4 oder ein gleichwertiges Objektiv.
Legen Sie nun ein Deckglas mit einem Durchmesser von 32 Millimetern in eine an das Mikroskop angepasste Halterung und befestigen Sie sie. Legen Sie die Immunstain-Zellprobe mit den Zellen nach unten auf den 32 Millimeter dicken Deckglas und fügen Sie einen Tropfen deionisiertes Wasser hinzu, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern. Platzieren Sie dann die Halterung mit dem Deckglas auf dem Mikroskoptisch über dem Objektiv.
Für die Bildgebung nach der Expansion legen Sie das Hydrogel auf den Deckglas und führen Sie einen Kachelscan durch. Verwenden Sie den Hellfeld- oder den Fluoreszenzmodus mit niedriger Laserintensität, um einen interessanten Bereich zu lokalisieren und zu fokussieren. Legen Sie dann die Bildaufnahmeparameter wie Scangeschwindigkeit, Mittelungszahl, Richtung, Scanmodus, Methode und Lochblendengröße fest, um die gewünschte Beobachtung zu erzielen.
Visualisieren Sie nun die Zellen in der Software im Live-Fluoreszenz-Modus. Erhöhen Sie allmählich die Laserleistung und passen Sie die Verstärkung und den Offset des Detektors an, um das Signal ohne übermäßiges Rauschen zu verstärken und eine klare Fluoreszenzvisualisierung ohne Überbelichtung zu gewährleisten. Führen Sie abschließend die Bildaufnahme durch und speichern Sie die Daten im gewünschten Format, wobei Sie sicherstellen, dass die richtigen Metadaten für die zukünftige Referenz enthalten sind.
Sobald die Erfassung abgeschlossen ist, fügen Sie eine kleine Menge deionisiertes Wasser hinzu, um den Transfer mit einer Pinzette zu erleichtern, und übertragen Sie die Probe zurück in die Sechs-Well-Platte. Der durchschnittliche Feret-Durchmesser des Kerns stieg von 17,7 Mikrometern vor der Expansion auf 70,3 Mikrometer nach der Expansion, was auf einen Expansionsfaktor von vier hinweist. Das Fibroblasten-Markierungsmuster vor der Expansionsmikroskopie zeigte eine ausgeprägte rote und grüne Fluoreszenz, die auf subzelluläre Details im Golgi-Apparat hinweist, jedoch mit begrenzter Auflösung, was eine Analyse im Tod verhinderte.
Nach der Expansionsmikroskopie wurde eine signifikant verbesserte räumliche Auflösung der subzellulären Strukturen beobachtet, wobei kompliziertere grüne und rote Vesikel innerhalb der Fibroblastenzellen sichtbar waren.
