El uso de la MCA para observar cambios tempranos después del trasplante de tejido ovárico tiene una ventaja significativa sobre los modelos in vitro, ya que permite investigar los mecanismos que afectan el proceso de vascularización temprana y pérdida de folículos. Esta técnica es económica y se puede realizar sin riesgo de rechazo del injerto debido a la inmunodeficiencia embrionaria natural durante los primeros 17 días. Además, este enfoque no plantea ninguna preocupación ética o jurídica en términos de la legislación europea.
La mejor estrategia para desarrollar las habilidades manuales necesarias para la manipulación de huevos puede alcanzarse mediante el entrenamiento con óvulos no embrionados antes del experimento real. Para comenzar, etiquete los huevos del día cero recibidos de pollitos de leghorn blanco seleccionados de Lovaina con un marcador. Incuba los huevos en una incubadora a 37 grados centígrados, con los extremos puntiagudos hacia abajo.
Gire los huevos 180 grados, dos o tres veces al día manualmente. En la oscuridad, coloque un candelabro de huevos contra la cáscara del huevo y señale el centro de la bolsa de aire en la cáscara del huevo con un marcador. Encienda las luces y gire un pasador recto estéril en la posición marcada para hacer una abertura de alrededor de un milímetro.
Localiza el saco vitelino en la oscuridad con el vela de huevos. Perfore el huevo con una aguja estéril de calibre 19, en un ángulo de 45 grados hacia el fondo del huevo, sin alterar el saco vitelino. Aspire de 1,5 a dos mililitros de albúmina para separar el CAM de la cáscara.
A continuación, cierre el agujero con cinta adhesiva. Enciende las luces y dibuja una ventana rectangular de uno por 1,5 centímetros en el huevo colocado horizontalmente. Sostenga el huevo con una mano y corte suavemente una ventana en la cáscara del huevo, con una hoja de sierra de marquetería, sin romper la cáscara.
Sople regularmente para eliminar el polvo y los escombros de la concha. Deslice las pinzas estériles debajo de la pieza rectangular de la carcasa y retírela limpiamente sin dañar el CAM. A continuación, deseche la membrana blanca de la capa externa para ver el embrión y la MCA.
En los óvulos embrionados viables, la albúmina clara, un anillo vascular alrededor del embrión y, a veces, un corazón latiendo, se observan en el tercer día del desarrollo del embrión de pollo. Debajo de la campana de flujo laminar, coloque el huevo en la rejilla para huevos con la ventana hacia arriba y retire la cinta. Coloque suavemente y retire inmediatamente una tira cuadrada de un centímetro de papel estéril para lentes extraído con éter sobre la superficie epitelial, para traumatizar una pequeña área de la MCA.
A continuación, agarre una tira cortical ovárica descongelada congelada con pinzas microquirúrgicas y colóquela sobre la MCA traumatizada con el lado medular contra la MCA. Evalúe el injerto macroscópicamente y preste especial atención a la reacción vascular de la MCA hacia el injerto antes de capturar fotografías o videos digitales. Una vez hecho esto, extraiga el injerto agarrando el tejido o el CAM circundante con fórceps y extirpando cuidadosamente el injerto del CAM con unas tijeras.
Los injertos fueron viables en el 100% de los casos después del primer día del injerto. Ya estaban parcialmente adheridos a la MCA y mostraban el patrón de radios de rueda de los vasos sanguíneos necesarios para su vascularización. Después de seis días de injerto, los implantes se adhirieron a la CAM.
Alrededor del tercer día después del trasplante, los injertos se cubrieron con una segunda capa de CAM y se encapsularon. El injerto mostró una buena vascularización, con un 80% de los trasplantes penetrando en el óvulo. Dos injertos no se adhirieron a la MCA y adquirieron un aspecto necrótico, lo que resultó en una tasa de supervivencia del tejido injertado del 83% después de seis días.
En la evaluación histológica del trasplante se observaron folículos sanos en todos los puntos temporales. Después del trasplante, se observó una disminución insignificante en las densidades de los folículos. Las tasas de supervivencia de los folículos se mantuvieron durante el período de injerto en un 95% el primer día y un 83% en el sexto día.
La parte más desafiante es hacer el pequeño orificio necesario para aspirar la albúmina, para separar el CAM de la cáscara del huevo, antes de crear una ventana de aplicación. Demasiada presión puede dar lugar a una sobreestimulación, o incluso puede agrietar y destruir el óvulo, causando daños irrevocables a la MCA o a su vasculatura. Este modelo es ideal para probar varios aspectos del período posterior al injerto temprano de tejido ovárico, incluido el impacto de los factores proangiogénicos, los agentes antioxidantes protectores, las citocinas, las hormonas y otros factores que controlan la activación del folículo y el crecimiento temprano.
Este modelo indicó la relación entre la vascularización temprana y la modulación de la activación del folículo, que son los dos eventos principales que resultan en la disminución de la reserva ovárica después del trasplante de tejido ovárico.
