Este protocolo permite la diferenciación eficiente y reproducible de adipocitos marrones que expresan factores de transcripción adipogénicos clave, marcadores de adipocitos maduros y tienen potencial termogénico y fenotipo morfológico de adipocitos marrones maduros. Se trata de un procedimiento de diferenciación en dos fases sencillo y replicable para obtener células con características de adipocitos marrones maduros a partir de tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos. Este protocolo permite estudiar los mecanismos de activación del tejido adiposo marrón como diana para el tratamiento de la obesidad.
Ha sido un modelo para determinar los mecanismos implicados en la fisiopatología de la lipodistrofia. Se espera que realizar esta técnica por primera vez sea un desafío. Es fundamental tener un protocolo detallado y enfatizar los puntos críticos para tener resultados exitosos.
Para comenzar, coloque al ratón sacrificado en posición prona y haga una incisión en la piel de un centímetro de largo en el nivel medio de la espalda del animal con unas tijeras afiladas. Retire la piel con cuidado, separe quirúrgicamente el iBAT de la carcasa con unas tijeras pequeñas. Coseche ambos lóbulos de iBAT con unos alicates de punta curva para eliminar los lóbulos de forma independiente.
Coloque los dos lóbulos en un tubo de plástico con 1,5 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente. Incubar los tejidos iBAT en un tampón de digestión de colagenasa tipo dos durante 45 minutos a 37 grados centígrados con una agitación suave y continua a 800 RPM. Interrumpe mecánicamente la suspensión tisular en el tampón de digestión de colagenasa tipo dos pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1000 y puntas de filtro.
Utilice una nueva punta para cada muestra. Pase los tejidos desegregados a través de filtros de células individuales de 100 micrómetros a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de tampón ACK a las muestras de tejido filtradas.
Invierta los tubos de cuatro a cinco veces e incube a temperatura ambiente durante cuatro minutos. A continuación, pase las suspensiones a través de un filtro de células de 40 micrómetros a nuevos tubos de 1,5 mililitros utilizando una micropipeta P1000 y puntas filtradas. La centrifusión resuspende el pellet como se describe en el manuscrito del texto.
A continuación, siembre cada muestra en seis pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos añadiendo un mililitro de la suspensión a cada pocillo. Los preadipocitos indiferenciados presentaron niveles muy bajos o indetectables de ppar-gamma, C/ebp-alfa, perilipina 1 y CD36. Por el contrario, estos marcadores fueron significativamente más altos en el séptimo día de diferenciación.
La acumulación de múltiples gotas de lípidos en los preadipocitos marrones fue consistente con los resultados publicados previamente. Se observó un aumento significativo en los niveles del marcador de masa mitocondrial TOM 20 y de la proteína del complejo de fosforilación oxidativa al séptimo día de diferenciación. UCP1, un marcador de buena fe de este tipo de células, no se detectó en preadipocitos indiferenciados, mientras que se expresó sustancialmente en adipocitos marrones maduros en el séptimo día de diferenciación.
Las mitocondrias evolucionaron de una forma tubular alargada en el día cero a una forma redondeada o similar a un frijol en el día siete. La estructura interna mitocondrial también fue modificada por la adipogénesis, lo que resultó en una mayor densidad de las crestas empaquetadas paralelamente. Es importante destacar que las mitocondrias estaban íntimamente asociadas con las gotas de lípidos en los adipocitos marrones diferenciados, por lo que no se pudo detectar una distancia discernible entre la membrana externa de las mitocondrias y las superficies de las gotas de lípidos, incluso con microscopía electrónica de transmisión de alta resolución.
La extirpación quirúrgica del tejido adiposo interescapular es fundamental. Una cantidad ineficiente de tejido limita la disponibilidad de células que se diferenciarán. Esta técnica de imagen ayuda a caracterizar la morfología de los adipocitos marrones diferenciados in vitro.
Es posible realizar ensayos para la función mitocondrial, la activación beta-androgénica y la inhibición autofágica.
