يسمح هذا البروتوكول بالتمايز الفعال والقابل للتكرار للخلايا الشحمية البنية التي تعبر عن عوامل النسخ الشحمية الرئيسية ، وعلامات الخلايا الشحمية الناضجة ، ولها إمكانات حرارية ونمط ظاهري مورفولوجي للخلايا الشحمية البنية الناضجة. هذا إجراء تمايز بسيط وقابل للتكرار على مرحلتين للحصول على خلايا ذات خصائص الخلايا الشحمية البنية الناضجة من الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين للفئران حديثي الولادة. يسمح هذا البروتوكول بدراسة آليات تنشيط الأنسجة الدهنية البنية كهدف لعلاج السمنة.
لقد كان نموذجا لتحديد الآليات المشاركة في الفيزيولوجيا المرضية للحثل الشحمي. من المتوقع أن يكون تنفيذ هذه التقنية لأول مرة أمرا صعبا. من الضروري أن يكون لديك بروتوكول مفصل والتأكيد على النقاط الحرجة لتحقيق نتائج ناجحة.
للبدء ، ضع الماوس الرحيم في وضع الانبطاح وقم بعمل شق جلدي بطول سنتيمتر واحد في منتصف ظهر باستخدام مقص حاد. قم بإزالة الجلد بعناية ، وافصل iBAT جراحيا عن الذبيحة باستخدام مقص صغير. احصد كلا فصوص iBAT باستخدام كماشة طرف منحنى لإزالة الفصوص بشكل مستقل.
ضع الفصين في أنبوب بلاستيكي يحتوي على 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم في درجة حرارة الغرفة. احتضان أنسجة iBAT في محلول هضم كولاجيناز من النوع الثاني لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف مستمر عند 800 دورة في الدقيقة. قم بتعطيل تعليق الأنسجة ميكانيكيا في محلول الهضم من النوع الثاني من الكولاجين عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 الدقيقة وأطراف المرشح.
استخدم نصيحة جديدة لكل عينة. مرر الأنسجة غير المنفصلة من خلال مصافي خلايا فردية 100 ميكرومتر إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ACK إلى عينات الأنسجة المفلترة.
اقلب الأنابيب من أربع إلى خمس مرات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. ثم مرر المعلقات من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة P1000 الدقيقة والأطراف المفلترة. يعيد Centrifusion تعليق الحبيبات كما هو موضح في مخطوطة النص.
ثم قم بزرع كل عينة في ستة آبار من صفيحة استزراع 24 بئرا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المعلق إلى كل بئر. قدمت الخلايا preadipocytes غير المتمايزة مستويات منخفضة جدا أو لا يمكن اكتشافها من ppar-gamma و C / ebp-alpha و perilipin 1 و CD36. في المقابل ، كانت هذه العلامات أعلى بكثير في اليوم السابع من التمايز.
كان تراكم قطرات الدهون المتعددة في الخلايا preadipocytes البنية متسقا مع النتائج المنشورة سابقا. لوحظت زيادة كبيرة في علامة كتلة الميتوكوندريا TOM 20 ومستويات البروتين المعقدة للفسفرة التأكسدية في اليوم السابع من التمايز. UCP1 ، لم يتم الكشف عن علامة جيدة لهذا النوع من الخلايا في الخلايا preadipocytes غير متمايزة بينما تم التعبير عنها بشكل كبير في الخلايا الشحمية البنية الناضجة في اليوم السابع من التمايز.
تطورت الميتوكوندريا من شكل أنبوبي ممدود في اليوم صفر إلى شكل دائري أو يشبه الفول في اليوم السابع. تم تعديل الهيكل الداخلي للميتوكوندريا أيضا عن طريق تكوين الدهون ، مما أدى إلى زيادة كثافة الكريستال المعبأ المتوازي. الأهم من ذلك ، أن الميتوكوندريا كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا بقطرات الدهون في الخلايا الشحمية البنية المتمايزة ، لذلك لا يمكن اكتشاف مسافة واضحة بين الغشاء الخارجي للميتوكوندريا وأسطح قطرات الدهون ، حتى مع المجهر الإلكتروني عالي الدقة.
الاستئصال الجراحي للأنسجة الدهنية بين الكتفين أمر بالغ الأهمية. كمية غير فعالة من الأنسجة تحد من توافر الخلايا التي سيتم تمييزها. تساعد تقنية التصوير هذه في توصيف مورفولوجيا الخلايا الشحمية البنية المتمايزة في المختبر.
من الممكن إجراء فحوصات لوظيفة الميتوكوندريا ، وتنشيط بيتا أندروجيني ، وتثبيط الالتهام الذاتي.
