Por lo tanto, utilizando este protocolo, podemos visualizar citonemas en tejido fijo de ratón en todo el embrión con microscopía de luz estándar. Usando esta técnica, podemos sondear proteínas de señalización endógenas que viajan a lo largo de los citonemas, en lugar de confiar en modelos de ratón manipulados genéticamente que utilizan proteínas marcadas fluorescentemente. Al intentar este protocolo, es importante manejar suavemente las secciones de tejido para la preservación óptima de los citonemas.
Demostrando este procedimiento estarán Miriam Dillard, investigadora principal de mi grupo, y Christina Daly, estudiante graduada de St.Jude. Para comenzar, use tijeras y fórceps de disección para hacer una incisión en Y en la cavidad peritoneal. Extirpar el útero que contiene E 9.5 embrión.
Diseccionar los embriones en medio de crecimiento DMEM completo. Use fórceps para eliminar la yema SAC, la placenta y las membranas circundantes. Enjuague los embriones aislados en HBSS para eliminar cualquier tejido amniótico residual y sangre.
A continuación, prepare el fijador agregando paraformaldehído a HBSS para una concentración de trabajo de 4% de paraformaldehído. Agregue un mililitro de esta solución a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Coloque los embriones en pozos individuales.
Incubar los embriones durante 45 minutos con agitación suave en un balancín. Después de la incubación, retire el fijador y lave los embriones tres veces, durante 30 minutos en PBS con calcio, magnesio y tritón al 0,1%. Luego incube los embriones en solución de bloqueo con agitación suave dos veces, durante una hora cada uno.
Después de la segunda incubación, enjuague los embriones con una solución de bloqueo fresca. Mientras tanto, prepare la solución primaria de anticuerpos diluyendo los anticuerpos en PBS suplementado. Una vez que se complete el enjuague, retire la solución de bloqueo y agregue un mililitro de solución de anticuerpos primarios a cada pocillo.
Incubar la placa a cuatro grados centígrados con una rotación suave durante tres días. Después de la incubación primaria de anticuerpos, lave los embriones con PBS suplementado cinco veces durante una hora en un balancín a 20 RPM. Luego agregue un mililitro de solución de anticuerpos secundarios a cada pocillo.
Incubar el plato con un balanceo suave a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante tres días. Retire la solución secundaria de anticuerpos y lave los embriones tres veces durante 30 minutos en PBS suplementado. Preparar una solución al 4% en peso de agarosa de bajo punto de fusión en PBS con calcio y magnesio.
Simultáneamente, coloque una placa de 12 pocillos en el baño de cuentas de 55 grados Celsius y agregue tres mililitros de agarosa a cada pozo. A continuación, coloque el plato en una mesa de trabajo y transfiera los embriones a pozos individuales con una cuchara perforada. Use puntas de pipeta para incrustar y orientar suavemente el embrión de tal manera que esté centrado dentro de la solución.
Una vez que los embriones estén orientados, coloque la placa a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos para la solidificación. Luego, con un bisturí, retire todo el bloque de agarosa del pozo. Cortar un bloque rectangular alrededor del embrión, dejando aproximadamente 0,3 centímetros del bloque a cada lado.
Deje una longitud adicional del bloque a lo largo del extremo caudal del embrión. Para montar el embrión en el vibratomo, primero aplique una tira de cinta adhesiva al soporte de la muestra. Oriente el embrión en posición vertical en la sección superior del bloque y súper pegue el bloque de agarosa a la cinta, de modo que la cuchilla genere secciones axiales en una secuencia anterior a posterior.
A continuación, llene la cámara del vibratomo con HBSS frío para sumergir completamente la muestra y luego rodee la cámara con hielo. Establezca los parámetros en el vibratomo y realice la sección axial en serie del embrión. Use fórceps para transferir secciones individuales a un plato separado lleno de HBSS.
Recuerde usar fórceps para sostener solo la agarosa para evitar el daño tisular y la destrucción de los citonemas. Para realizar la tinción de F-actina, retire hbSS e incube las secciones durante 40 minutos con ActinRed y solución DAPI en PBS suplementado. Después de la incubación, lave las secciones tres veces durante 20 minutos en PBS suplementado.
Con un rotulador hidrofóbico, dibuje una barrera alrededor de los bordes de un portaobjetos de microscopio cargado y agregue un pequeño volumen de HBSS al área de llenado. Luego, use fórceps para transferir secciones a la diapositiva. Retire el exceso de agarosa con fórceps.
Una vez que todas las secciones se hayan transferido a la corredera, retire el exceso de líquido mediante pipeteo y utilizando la esquina de una toallita absorbente. A continuación, agregue varias gotas de medio de montaje a la diapositiva. Monte el resbalón de la cubierta colocándolo suavemente en la corredera.
Para el análisis, realice imágenes de las secciones de tejido para un mínimo de tres embriones por genotipo en un microscopio confocal o de alta resolución. Aquí se muestran las secciones correctamente orientadas preparadas con este protocolo. En comparación con la seccionamiento del vibratomo, la sección criostatal del tejido no preservó las extensiones celulares.
Se detectaron algunos fragmentos de membrana GFP positivos entre las células de la notocorda y el tubo neural, y entre las células adyacentes del tubo neural en las secciones de criostato. Sin embargo, la tinción de F-actina de las extensiones celulares en las células mesenquimales que rodean el tubo neural se vio afectada en las secciones de criostato. La seccionamiento del vibratomo aseguró una interrupción mínima de todo el embrión y las secciones de tejido individuales.
Las secciones manejadas de manera óptima permitieron la detección de ctionemas entre las células epiteliales neurales de la placa del piso localizadas adyacentemente y las células mesenquimales. Las secciones plegadas o abrochadas eran evidentes por una gran separación entre la notocorda y la placa del piso ventral del tubo neural. Y una pérdida de extensiones de membrana celular que migran entre las células epiteliales.
Las secciones teñidas con F-actina y DAPI tenían un espaciado consistente de células mesenquimales y ctionemas que rodean el tubo neural y la notocorda. Las distorsiones menores en las secciones pueden haber causado la fragmentación de las extensiones basadas en actina y la formación de grandes espacios entre las células, lo que subraya la necesidad de un manejo delicado. Después de la seccionamiento del embrión, es imperativo minimizar cualquier flexión o plegamiento de las secciones de tejido.
para prevenir la rotura de los citonemas. Usando esta técnica, podemos visualizar directamente cómo las moléculas de señalización, como los morfógenos, se propagan a través de los tejidos. Esto nos está dando nuevos conocimientos sobre cómo se modelan los tejidos y los órganos.
