Este protocolo SiMPull permite una cuantificación de la fosforilación de proteínas al mejorar el etiquetado de anticuerpos y las condiciones de fijación, reducir la autofluorescencia que se encuentra en el canal verde y proporcionar algoritmos robustos de análisis de moléculas individuales. La principal ventaja de SiMPull es que nos permite interrogar el estado de fosforilación de proteínas intactas individuales. Con este método, podemos obtener información novedosa que no es accesible a través de técnicas tradicionales, como western blotting y análisis de especificaciones de masas.
Tenemos un equipo de investigadores para ayudar a demostrar el protocolo. En primer lugar, Julián Rojo mostrará cómo grabar pirañas en el vidrio de la cubierta. Rachel Grattan mostrará los pasos para el recubrimiento del vidrio de la cubierta.
Y Elizabeth Bailey mostrará cómo dibujar la matriz y las muestras de imágenes. Para comenzar, la piraña graba los resbalones de la cubierta agitando suavemente el vaso de precipitados de reacción cada cinco minutos durante 30 minutos. Neutralizó la solución de piraña agregando gradualmente una base débil.
Con una varilla de vidrio, transfiera los deslizamientos de la cubierta grabada a un embudo de Buchner y enjuague durante cinco minutos en agua destilada doble. Luego coloque los resbalones de la cubierta en un frasco de vidrio Coplin y cúbralos con metanol. Selle la tapa con una película de sellado y sonicato de baño durante 10 minutos.
Después de la sonicación, vacíe el metanol en una botella de almacenamiento de vidrio. Repita este paso con acetona. Enjuague los resbalones de la cubierta tres veces con agua destilada doble en el frasco Coplin.
Escurra el agua de los resbalones de la cubierta y séquelos agitando la llama de un quemador Bunsen. Coloque los resbalones de la cubierta en un frasco de Coplin seco. Luego agregue la solución de amino silano al frasco de Coplin para realizar la aminosilización de deslizamiento de cubierta.
Cubra y aplique una película de sellado para proteger de la luz. Enjuague los resbalones de la cubierta con metanol y deseche la solución utilizada. Una vez más, enjuague los resbalones de la cubierta tres veces con agua destilada doble durante dos minutos cada uno.
Elimine el exceso de humedad y seque completamente al aire durante 10 minutos. A continuación, dibuje la matriz de rejilla con una pluma de barrera hidrofóbica. Marque un identificador en la hoja de la cubierta para identificar la orientación adecuada.
Después de que la tinta se seque, coloque los resbalones de la cubierta en una cámara humidificada. Resuspend 153 miligramos de mPEG y 3,9 miligramos de biotina-PEG en 609 microlitros de bicarbonato de sodio 10 milimolares y vórtice. Centrifugar a 10.000 x g desde un minuto a temperatura ambiente para eliminar burbujas.
Aplique de 10 a 15 microlitros de esta solución por cuadrado para cubrir completamente la matriz sin desbordamiento. Guarde los deslizamientos de la cubierta en la cámara de humedad en la oscuridad durante tres o cuatro horas a temperatura ambiente. Luego lave los resbalones de la cubierta sumergiéndolos durante 10 segundos secuencialmente en tres vasos de precipitados llenos de agua destilada doble.
Retire toda la humedad de los resbalones de la cubierta con gas nitrógeno. Guarde los resbalones de la cubierta espalda con espalda en un tubo cónico de 50 mililitros lleno de nitrógeno y selle con una película de sellado. Envuelva el tubo con una película de sellado y colóquelo a menos 20 grados centígrados.
Retire las matrices funcionalizadas de biotina-PEG del congelador y equilibre a temperatura ambiente. Coloque el resbalón de la cubierta con la matriz hacia arriba sobre un plato de cultivo de tejidos de 100 milímetros forrado con película de sellado. Incube cada cuadrado de la matriz con 10 miligramos por mililitro de borohidruro de sodio en PBS durante cuatro minutos a temperatura ambiente.
Lavar tres veces con PBS. A continuación, incubar con 0,2 miligramos por mililitro de NeutrAvidin en T50 durante cinco minutos, seguido de lavar tres veces con T50 BSA. Repita la incubación con dos microgramos por mililitro de anticuerpo biotinilado específico POI en T50 BSA durante 10 minutos seguido de lavado.
Primero, mezcle el lisado mediante pipeteo. Diluya un microlitro del lisado en 100 microlitros de PPI T50 BSA frío. Incubar el lisado en la matriz durante 10 minutos, seguido de lavado.
Prepare el anticuerpo antifosfototirosina conjugado AF647 en el PPI T50 BSA helado e incube en la matriz durante una hora. Deposite una gota de petróleo en el objetivo. Coloque la nanorred en el escenario para obtener imágenes.
Usando la luz blanca transmitida, concéntrese en el patrón de cuadrícula. Adquiere una serie de 20 imágenes de la cuadrícula, asegúrate de que los píxeles no estén saturados y guarda la serie de imágenes como fiducial. Desenfoque la nanorred para crear un patrón aireado, adquiera una serie de 20 imágenes para calibraciones de ganancia y guarde la imagen como ganancia.
A continuación, adquiera una serie de 20 imágenes para el desplazamiento de la cámara bloqueando toda la luz de la cámara y guarde el fondo de las imágenes. Para adquirir imágenes simples, primero, limpie el objetivo de aceite y deposite aceite adicional en el objetivo. Asegure la matriz de deslizamiento de la cubierta en el escenario del microscopio.
Adquiera imágenes para cada muestra, primero en el canal rojo lejano, seguido de fluoróforos de menor longitud de onda. Compruebe el nivel del búfer cada 30 a 45 minutos y reponga según sea necesario. Usando esta técnica, EGFR-GFP fue capturado de lisados de proteínas totales.
La autofluorescencia de la tinta hidrofóbica se utilizó como guía para encontrar el plano focal de la muestra. Las imágenes de datos en bruto se adquirieron con canales espectrales separados en el chip de la cámara. Se examinó más a fondo una superposición de los canales verde y rojo lejano para la adquisición de datos.
El registro del canal se realizó en imágenes adquiridas de la nanorred. Una superposición de imágenes fiduciales mostró un registro incompleto. La alineación se realizó aplicando una transformada media ponderada local en las coordenadas de los canales rojo lejano y verde, que se utilizó para registrar los datos posteriores de SiMPull.
Se almacenaron emisores individuales por encima del recuento de fotones de fondo de los canales GFP y AF647 y se realizó una localización gaussiana para identificar las ubicaciones. La colocalización de EGFR-GFP en un F647 se realizó para identificar receptores fosforilados. Y el porcentaje de colocalización se utilizó para determinar la fracción de receptores fosforilados.
Las detecciones de fondo se redujeron cuando el vidrio grabado con piraña se trató con borohidruro de sodio. Se observó una unión robusta de EGFR-GFP en el lisado con una unión mínima inespecífica PY99-AF647, mostrando retención de la funcionalización de la superficie utilizando esta técnica. SiMPull proporciona información sobre la fosforilación de proteínas y puede abordar una amplia gama de preguntas de autopuntuación.
Esto puede mejorar nuestra comprensión de la señalización tanto en estados normales como de enfermedad.
