يتيح بروتوكول SiMPull هذا إجراء تقدير كمي لفسفرة البروتين من خلال تحسين ظروف وضع العلامات على الأجسام المضادة وتثبيتها ، مما يقلل من التألق الذاتي الموجود في القناة الخضراء ويوفر خوارزميات قوية لتحليل جزيء واحد. الميزة الأساسية ل SiMPull هي أنه يسمح لنا باستجواب حالة الفسفرة للبروتينات الفردية السليمة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا الحصول على معلومات جديدة لا يمكن الوصول إليها من خلال التقنيات التقليدية ، مثل النشاف الغربي وتحليل مواصفات الكتلة.
لدينا فريق من الباحثين للمساعدة في إظهار البروتوكول. أولا ، سيوضح جوليان روخو كيفية حفر سمك البيرانا على زجاج الغطاء. ستعرض راشيل جراتان بعد ذلك خطوات طلاء زجاج الغطاء.
وستوضح إليزابيث بيلي كيفية رسم المصفوفة وعينات الصور. للبدء ، تنقش أسماك البيرانا الغطاء عن طريق تحريك كوب التفاعل بلطف كل خمس دقائق لمدة 30 دقيقة. تحييد محلول البيرانا عن طريق إضافة قاعدة ضعيفة تدريجيا.
باستخدام قضيب زجاجي ، انقل الغطاء المحفور إلى قمع Buchner وشطفه لمدة خمس دقائق في ماء مقطر مزدوج. ثم ضع الغطاء في جرة كوبلن زجاجية وقم بتغطيتها بالميثانول. أغلق الغطاء بفيلم مانع للتسرب وسونيكات الحمام لمدة 10 دقائق.
بعد الصوتنة ، قم بإفراغ الميثانول في زجاجة تخزين زجاجية. كرر هذه الخطوة مع الأسيتون. اشطف الغطاء ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج في جرة كوبلن.
استنزاف المياه من زلات الغطاء وتجفيفها عن طريق التلويح من خلال لهب موقد بنسن. ضع الغطاء في وعاء كوبلن جاف. ثم أضف محلول السيلان الأميني إلى جرة كوبلن لأداء السيلان الأميني الانزلاق التغطي.
قم بتغطية وتطبيق فيلم مانع للتسرب للحماية من الضوء. شطف زلات الغطاء مع الميثانول وتجاهل المحلول المستخدم. مرة أخرى ، اشطف الغطاء ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين لكل منهما.
تخلص من الرطوبة الزائدة وجففها في الهواء تماما لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، ارسم صفيف الشبكة باستخدام قلم حاجز مسعور. ضع علامة على معرف على قسيمة الغطاء لتحديد الاتجاه الصحيح.
بعد أن يجف الحبر، ضع الغطاء في غرفة رطبة. أعد تعليق 153 ملليغرام من mPEG و 3.9 ملليغرام من البيوتين-PEG في 609 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم والدوامة 10 ملليمولار. جهاز طرد مركزي عند 10،000 × غرام من دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الفقاعات.
ضع 10 إلى 15 ميكرولتر من هذا المحلول لكل مربع لتغطية الصفيف بالكامل دون أن يفيض. قم بتخزين الغطاء في غرفة الرطوبة في الظلام لمدة ثلاث إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل زلات الغطاء عن طريق غمسها لمدة 10 ثوان بالتتابع في ثلاثة أكواب مملوءة بالماء المقطر المزدوج.
قم بإزالة جميع الرطوبة من انزلاقات الغطاء باستخدام غاز النيتروجين. قم بتخزين الغطاء من الخلف إلى الخلف في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر مملوء بالنيتروجين وختم بفيلم مانع للتسرب. لف الأنبوب بفيلم مانع للتسرب وضعه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.
قم بإزالة المصفوفات الوظيفية البيوتين-PEG من الفريزر وقم بموازنتها مع درجة حرارة الغرفة. ضع الغطاء مع توجيه الصفيف لأعلى فوق طبق زراعة أنسجة 100 ملم مبطن بفيلم مانع للتسرب. احتضن كل مربع من الصفيف ب 10 ملليغرام لكل ملليلتر من بوروهيدريد الصوديوم في PBS لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة.
يغسل ثلاث مرات مع PBS. بعد ذلك ، احتضن 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر من NeutrAvidin في T50 لمدة خمس دقائق ، يليه غسل ثلاث مرات باستخدام T50 BSA. كرر الحضانة مع ميكروغرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة الخاصة ب POI البيوتينيل في T50 BSA لمدة 10 دقائق تليها الغسيل.
أولا ، قم بإذابة مزيج الليزات عن طريق السحب. تمييع ميكرولتر واحد من lysate إلى 100 ميكرولتر من الثلج البارد T50 BSA PPI. احتضن الليزات على الصفيف لمدة 10 دقائق ، تليها الغسيل.
تحضير AF647 اقتران الجسم المضاد للفوسفوتيروزين في الثلج البارد T50 BSA PPI واحتضان على صفيف لمدة ساعة واحدة. إيداع قطرة من النفط على الهدف. ضع الشبكة النانوية على المسرح للتصوير.
باستخدام الضوء الأبيض المرسل ، ركز على نمط الشبكة. احصل على سلسلة من 20 صورة للشبكة ، وتأكد من عدم تشبع وحدات البكسل واحفظ سلسلة الصور على أنها ائتمانية. قم بإلغاء تركيز الشبكة النانوية لإنشاء نمط متجدد الهواء ، والحصول على سلسلة من 20 صورة للحصول على معايرات الكسب وحفظ الصورة كمكسب.
ثم احصل على سلسلة من 20 صورة لإزاحة الكاميرا عن طريق حجب كل الضوء عن الكاميرا وحفظ خلفية الصور. للحصول على صور بسيطة ، أولا ، قم بتنظيف هدف الزيت وإيداع زيت إضافي على الهدف. قم بتأمين صفيف انزلاق الغطاء على مرحلة المجهر.
احصل على صور لكل عينة، أولا في القناة الحمراء البعيدة، تليها فلوروفورات ذات طول موجي أقل. تحقق من مستوى المخزن المؤقت كل 30 إلى 45 دقيقة وقم بتجديده حسب الحاجة. باستخدام هذه التقنية ، تم التقاط EGFR-GFP من إجمالي البروتين lysates.
تم استخدام التألق الذاتي للحبر الكارهة للماء كدليل للعثور على المستوى البؤري للعينة. تم الحصول على صور البيانات الخام مع قنوات طيفية منفصلة على شريحة الكاميرا. تم فحص تراكب القنوات الخضراء والحمراء البعيدة للحصول على البيانات.
تم تسجيل القناة على الصور التي تم الحصول عليها من الشبكة النانوية. وأظهر تراكب من الصور الائتمانية تسجيلا غير مكتمل. تمت المحاذاة من خلال تطبيق تحويل متوسط مرجح محلي على إحداثيات القناة الحمراء والخضراء البعيدة ، والتي تم استخدامها لتسجيل بيانات SiMPull اللاحقة.
تم وضع بواعث واحدة فوق عدد الفوتونات الخلفية من قنوات GFP و AF647 في صندوق وتم إجراء توطين غاوسي لتحديد المواقع. تم إجراء التوطين المشترك ل EGFR-GFP في F647 لتحديد المستقبلات المفسفرة. وتم استخدام النسبة المئوية للتوطين المشترك لتحديد جزء المستقبلات المفسفرة.
تم تقليل عمليات الكشف عن الخلفية عندما تم التعامل مع الزجاج المحفور في أسماك البيرانا ببوروهيدريد الصوديوم. لوحظ وجود ربط قوي ل EGFR-GFP في الليزات مع الحد الأدنى من ربط PY99-AF647 غير المحدد ، مما يدل على الاحتفاظ بوظائف السطح باستخدام هذه التقنية. يوفر SiMPull معلومات حول فسفرة البروتين ويمكنه معالجة مجموعة واسعة من أسئلة الإشارة الذاتية.
هذا يمكن أن يعزز فهمنا للإشارة في كل من الحالات الطبيعية والمرضية.
