El daño al estroma corneal adulto conduce a una respuesta rápida de curación de heridas que compromete la visión debido a la formación de tejido cicatricial opaco. Este protocolo genera heridas en córneas embrionarias de pollitos que a diferencia de los adultos, pueden cicatrizar sin cicatriz. Dada la capacidad intrínseca de la córnea embrionaria lesionada para someterse a una recapitulación completa de la estructura corneal nativa sin cicatrices detectables, el pollito embrionario sirve como un modelo animal importante para dilucidar los factores moleculares y celulares para la cicatrización de heridas corneales sin cicatrices.
El aspecto más desafiante de esta técnica es generar una herida consistente que penetra tanto en el epitelio más externo como en el estroma corneal más profundo. A medida que uno aprende, puede ser útil ver las córneas heridas en una sección transversal para que se pueda evaluar la profundidad de la penetración de la herida en el estroma corneal. Para comenzar, coloque los huevos horizontalmente en una bandeja y márquelos en la parte superior del huevo para denotar la posición esperada del embrión.
Incubar estos huevos en una incubadora humidificada de 38 grados Celsius con la función de balanceo activada. Retire el huevo de la incubadora en el tercer día de desarrollo embrionario y colóquelo horizontalmente en un soporte de huevo seguro. Cree un pequeño agujero en la parte superior de la cáscara del huevo cerca del extremo puntiagudo del huevo usando el extremo afilado de las tijeras de disección.
Inserte una aguja hipodérmica biselada calibre 18 a través del orificio. Con la aguja empujada hacia la parte inferior de la superficie interna del huevo y el lado biselado de la aguja mirando hacia el extremo puntiagudo del huevo, retire de dos a tres mililitros de la albúmina del huevo de gallina y deseche. Limpie la superficie de la cáscara de huevo que rodea el orificio con toallitas sin pelusa, ligeramente humedecidas con etanol al 70% y seque en seco.
Selle el orificio hecho para eliminar la albúmina con cinta transparente. Con el extremo afilado de las tijeras de disección, haga un segundo agujero en la ventana en la parte superior de la cáscara del huevo. Asegúrese de que las tijeras no se extiendan demasiado dentro de la cáscara del huevo para evitar el contacto y el daño del embrión o la vasculatura embrionaria colocada directamente debajo del lado del segundo orificio.
Usando pinzas curvas, ensanche el orificio de la ventana para abarcar aproximadamente dos o tres centímetros de diámetro para revelar y obtener acceso al embrión en desarrollo debajo de la cáscara. Ahora, inserte un extremo de las pinzas en el agujero, manteniéndolo paralelo y yuxtapuesto estrechamente con la cáscara del huevo. Con el extremo de las otras pinzas colocadas fuera de la cáscara del huevo, pellizque cuidadosamente los dos extremos de las pinzas juntas, lo que les permite romperse y eliminar pequeños trozos de la cáscara del huevo.
Continúe rompiendo y eliminando los fragmentos de cáscara de huevo hasta que quede una ventana de dos a tres centímetros que se superponga directamente al embrión. Para limitar la contaminación bacteriana, agregue de 100 a 200 microlitros de solución de timbre que contenga 50 unidades por mililitro de penicilina y 50 microgramos por mililitro de estreptomicina a través del orificio de la ventana. Selle el orificio de la ventana con cinta adhesiva transparente.
Realice este sellado de huevos alineando una esquina de la cinta en el eje largo del orificio y presionando la cinta contra la cáscara a uno o dos centímetros de distancia del borde del agujero. Continúe sellando alrededor de la abertura hasta que quede una solapa colgante de cinta adhesiva en un lado. Presione los dos trozos de cinta juntos, creando una forma abovedada sobre el orificio y presione la solapa de cinta colgante a la cáscara para terminar de sellar el huevo.
Devuelva los huevos con ventanas a la incubadora para un mayor desarrollo. Asegúrese de mantener estos huevos horizontales y apague la función de balanceo de las incubadoras. Use un microscopio de disección para asegurarse de que el embrión se encuentra en la etapa de desarrollo adecuada y localizar las posiciones de la membrana amniocoriónica y la membrana corioalantoica.
Luego use tijeras de microdisección esterilizadas para cortar un agujero en la membrana amniocoriónica directamente sobre la extremidad anterior que se extiende desde la membrana, cubriendo la extremidad anterior hasta la membrana que recubre la cabeza. Use dos pares de fórceps estériles finos y agarre suavemente el amnios en dos posiciones adyacentes entre la membrana amniocorónica ACM y la membrana corioalantoica. Mueva cuidadosamente cada par de fórceps, ambos agarrando firmemente la membrana amniótica, lejos el uno del otro con un par moviéndose dorsalmente hacia el embrión y el otro ventralmente.
Use fórceps finos esterilizados para diseccionar y eliminar cualquier membrana amniónica restante que cubra el embrión. Usando fórceps esterilizados, agarre el amnios cerca de la región craneal media del embrión y tire cuidadosamente del amnioso en una dirección de mimo con respecto al embrión hacia la membrana corioalantoica desplazada anteriormente. Vuelva a sellar el orificio de la ventana con cinta transparente como se describe en el manuscrito y devuelva el huevo a la incubadora para su posterior desarrollo.
Es posible que sea necesario reposicionar las membranas embrionarias adicionales para garantizar que el ojo derecho sea accesible. Si el ojo derecho no es accesible para la herida debido a la posición del embrión en el óvulo, puede servir como un control no herido. Use un cuchillo de microdisección para hacer una incisión que abarque la extensión de la córnea del ojo derecho, que es paralela y está en línea con el tejido coroideo.
Utilice el cuchillo de microdisección para volver a lacerar la córnea en el mismo lugar que la primera incisión, dos veces más de tal manera que el corte dos y el corte tres ocurran junto con la misma posición en la córnea que el corte uno. Para ayudar con la viabilidad, use las pinzas de iris curvas para volver a meter el embrión debajo de la membrana corioalantoica después de la cirugía para promover el crecimiento adecuado de la membrana corioalantoica. A continuación, agregue de tres a cuatro gotas de solución de ringer que contenga antibióticos para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
Vuelva a sellar el orificio de la ventana con cinta transparente y vuelva a la incubadora, dejando el huevo horizontal. Permita que el embrión se desarrolle y que la herida corneal sane durante el período deseado. Después de la incubación, eutanasia el embrión y use fórceps de iris curvos para cosechar el ojo en una placa de Petri de la solución salina de Ringer agarrando suavemente el ojo en su lado posterior donde se encuentran el ojo y el tejido facial y levantando cuidadosamente todo el ojo lejos y libre del tejido facial.
Use fórceps finos para perforar un pequeño orificio de tres a cinco centímetros en la parte posterior de todo el ojo y fije todo el ojo en paraformaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante la noche con agitación leve. Para lograr una herida ideal, es crucial usar un cuchillo de microdisección afilado y aplicar la cantidad correcta de presión durante la laceración. La aplicación de muy poca presión dará lugar a una herida poco profunda que desgarra el epitelio corneal sin penetrar lo suficiente en el estroma anterior.
Aplicar demasiada presión da como resultado una herida de extensión completa que penetra en todo el estroma y expone el humor acuoso al entorno externo. Llevar a cabo las incisiones lacerantes adecuadas produce una herida ideal que inicialmente se agranda de cero a tres días después de la herida. Después de eso, se produce una reepitelización y la formación de nuevo tejido para finalmente cerrar la herida de una manera libre de cicatrices a los 11 días, después de la herida.
Se encontró que la localización espaciotemporal de las proteínas de la matriz extracelular, la fibronectina y la tenascina dentro de la herida cicatrizante estaba elevada en los puntos de tiempo correspondientes a la reepitelización corneal, lo que sugiere su participación en el cierre de la herida, la migración de células epiteliales y la supervivencia. La inmunohistoquímica de montura entera reveló que los nervios que yuxtaponen directamente la córnea central herida se inhiben temporalmente del tejido corneal curativo. A pesar de la inhibición anterior, los nervios corneales eventualmente inervan el tejido corneal completamente curado 11 días después de la herida a niveles de densidad similares y en patrones similares a la etapa de controles no heridos embrionarios día 18.
Como lo demuestran las imágenes armónicas de segunda generación, se ven haces de fibras de colágeno a lo largo de diferentes profundidades de la herida central de la córnea dispuestas ortogonalmente, que coinciden con la macroestructura nativa del tejido corneal central no herido. Cuando se combina con los enfoques clásicos de biología del desarrollo, como el injerto de tejido y la implantación de perlas, así como los enfoques modernos para la manipulación de genes, como la infección retroviral y la electroporación de ADN, este modelo animal promete revelar factores moleculares y mecanismos celulares necesarios para promover la cicatrización de heridas de córnea sin cicatrices. Determinar los factores moleculares clave en las proteínas de la matriz que regulan la cicatrización de heridas fetales sin cicatrices allanará el camino para terapias que fomenten un proceso de curación más restaurador con menos cicatrices y una mejor recapitulación de la arquitectura normal del tejido.
