Los autores agradecen a Ruth Zelkha, MS, por su generosa ayuda en la formación de imágenes. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Desarrollo Clínico Científico Premio K12EY021475 a mí, conceder R01 EY024349-01A1 de ARD, el núcleo EY01792 subvención del Instituto Nacional del Ojo, NIH, y una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera. ARD es el destinatario de un Premio desarrollo de la carrera de investigación para prevenir la ceguera.

Todos los procedimientos realizados en animales cumplen con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaraciones para el uso de animales en la investigación de la visión. Se utilizaron cuatro a catorce 6J de seis meses de edad, macho / hembra C57BL / tipo salvaje: diez ratones para el modelo de lesión y cuatro como animales de control (córneas no heridos). 1. Preparación de los animales <ol><li> Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de una 100 mg / kg de ketamina y 5 mg mezcla de xilazina / kg. Después de la anestesia ha hecho efecto, pellizcar el dedo para confirmar la profundidad de la anestesia; el animal no debe reaccionar. </li><li> Inspeccionar el ojo bajo una lámpara de hendidura antes de realizar los experimentos para comprobar la ausencia de cualquier lesión en la córnea anterior. </li><li> Inculcar una gota de clorhidrato de tetracaína 1% sobre el ojo. Después de 60 - 90 segundos, probar el reflejo corneal para confirmar la ausencia de sensación. Proparacaína clorhidrato de 0,5% se puede usar en su lugar. </li><li> Cuando la pérdida de sensación corneal escierto, coloque suavemente una gota de 5% de povidona-yodo en el ojo y en el cabello alrededor del ojo. Limpie la gota después de 1 min o difundirlo en el pelo alrededor de los ojos para evitar que el pelo interfiera con la punta de la herramienta. </li></ol> 2. Dispositivo de abrasión del epitelio corneal <ol><li> Use guantes quirúrgicos y una bata. Preparar las herramientas necesarias: una fresa rotativa estéril y un par de pinzas estériles. Para un mejor control, utilizar pinzas dobladas. Coloque las herramientas en una hoja estéril durante el procedimiento. </li><li> Usando las pinzas dobladas, estabilizar el ojo por el acaparamiento de las tapas desde el lado nasal y proptosing suavemente el ojo. Evitar el uso de demasiada presión. </li><li> Bajo un microscopio quirúrgico, afeitarse 360 ​​° alrededor de la zona del limbo dos veces utilizando la fresa rotativa estéril. Ir alrededor del limbo con una velocidad de 5-6 seg por ronda. NOTA: La rebaba tiene una velocidad fija. Sin embargo, para que gire a la velocidad establecida, la &quot;tuerca del extremo&quot; debe estar completamente apretado. </li><li> Retire todo el epitelio de la córnea de limbo a limbo con la rebaba rotatoria. Para obtener mejores resultados, mueva la herramienta en forma circular y mantenga un tanto paralela a la superficie de la córnea para trabajar con la parte lateral de la punta. Tenga cuidado de no dañar el estroma por no vuelve a cepillar las áreas donde el epitelio ya ha sido retirado. No aplicar ninguna presión en el ojo. Limpiar la punta del pincel según sea necesario. </li><li> Inculcar una gota de solución salina tamponada con fosfato estéril sobre la córnea y limpie las hojas epiteliales independiente con un tejido suave de limpieza. </li><li> Afeitarse el epitelio restante, en su caso. </li><li> Prestar atención a la cola del ratón durante la cirugía. NOTA: Si se produce cualquier movimiento, la profundidad de la anestesia se ha desvanecido y se requiere aún más la inyección. Un tercio a dos tercios del volumen inyectado primario debe ser suficiente. No exceder la dosis al animal con la medicación anestésica. </li><li> Esterilizar todas las herramientas antes de utilizarlas en otro ojo. </li></ol> 3. Confirmar la eliminación completa epitelial <ol><li> Aplicar una gota de 1 mg / ml de fluoresceína de sodio en la córnea. Limpiar la córnea después de 30 segundos y examinarla bajo el microscopio con un filtro azul de cobalto para verificar la eliminación completa del epitelio. NOTA: Las áreas de la córnea con defectos epiteliales se visualizan en verde. </li></ol> 4. Después de la operación de atención <ol><li> El sacrificio del animal en una manta de calefacción y guardarlo en un lugar seguro (por ejemplo, en su jaula), mientras que bajo la recuperación. No mantenga un animal inconsciente en compañía de los conscientes. </li><li> Aplicar 1% pomada oftálmica de eritromicina. Esto también evitará que la sequedad del ojo. Continuar la aplicación del antibiótico diaria durante una semana. </li><li> Inyectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea después del procedimiento y de nuevo después de 12 hr. Continuar la inyección dos veces al día durante dos días. </li><li> Observe que el animal de 30 - 45 minutos, hasta que la recuperación completa de la anestesia. NOTA: Leve movimiento de los músculos respiratorios en la superficie ventral indica el bienestar de los animales, mientras que bajo la recuperación. </li></ol>

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E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

En este artículo se describe una técnica reproducible y relativamente sencillo para crear un modelo de ratón de LSCD. Hay varios aspectos importantes de este modelo que vale la pena destacar. En primer lugar, a diferencia de los modelos que utilizan productos químicos 11, 12, la lesión implica principalmente el epitelio de la superficie (y la membrana basal), con un daño mínimo al estroma corneal subyacente o a otras estructuras intraoculares. Por lo tanto, no hay más que la inflamación y la cicatrización limitada, los cuales pueden complicar el procedimiento y hacerlo más difícil evaluar el resultado de las intervenciones dirigidas a las células madre del limbo. Un estudio reciente interesante por Li et al. 10, que compara el uso de la fresa que gira con diferentes combinaciones de tratamientos quirúrgicos y químicos, también encontró la rebaba que es más seguro y más eficaz en la creación de SIL en conejos. En segundo lugar, el modelo parece ser estable durante al menos tres meses hasta 1. La creación de este modelo implica el uso dela rebaba de rotación, un instrumento que es familiar para los médicos que trabajan con la córnea, así como a aquellos que lo hacen los estudios hirientes ratón. Su ventaja sobre el uso de una espátula roma es que la lesión es más uniforme y reproducible 1. Para destruir las células mejor madre del limbo, el área límbica se trató dos veces. Basado en la experiencia de trabajo en los ojos del ratón, el tratamiento de más de dos rondas menudo desgasta los vasos sanguíneos del limbo y causa hemorragia. En el caso de la técnica se utiliza en otros animales, este paso podría modificarse en función del espesor del epitelio corneal. En este estudio, se utilizó una herramienta motorizada con una punta de rebabas 0,5 mm; consejos de rebabas en otras formas y tamaños también están disponibles y se pueden utilizar en lugar, dependiendo de las especificaciones de la córnea y en el tamaño del ojo. Li et al. 10 informaron de la fresa de 2,5 mm para ser adecuado para eliminar sistemáticamente la córnea de conejo y el epitelio limbar. Para obtener la óptimade resultados, los epitelios del limbo de la córnea y se afeitaron en forma circular y se utilizó el lado lateral de la rebaba. Para evitar que el pelo de los animales de interferir con la punta de la herramienta, la caída de la povidona yodada se extendió sobre el cabello alrededor del ojo, en lugar de ser borrados. La herramienta no debe ser operado de forma estática en un punto, ya que esto puede causar perforación. El tratamiento del limbo a un ritmo muy lento puede provocar una hemorragia; una velocidad de casi 6 segundos por vuelta es adecuado para un ojo de ratón C57BL / 6J. Es de suma importancia para evitar la re-cepillado del estroma desnudo, ya que esto inducirá a más inflamación y la opacificación de la estroma. La presión no debe ser aplicado al ojo mientras abrasión del epitelio. Después del procedimiento, la córnea se tiñó con fluoresceína para asegurarse de extracción epitelial completa. Es importante evitar la sequedad del ojo durante la recuperación de los animales. Las limitaciones son que esta técnica no puede eliminar el 100% de las células madre. También es algo que depende del operador y requiere de práctica para dar a consistent resultados. Cuando se estudia el fenotipo epitelial corneal, toda la tinción de montaje es la mejor manera de evaluar el resultado de este modelo. Esto se debe a que permite que todo el epitelio corneal a ser evaluada a la vez, mientras que las secciones transversales sólo se dará información sobre cada sección particular. Esta técnica controlable puede inducir SIL en ratones, y probablemente en otros animales también. Proporciona un modelo adecuado de SIL para estudiar nuevos tratamientos y descubrir los aspectos más amplios de la fisiopatología de la enfermedad. Con algunas modificaciones, puede ser útil en el estudio de la cicatrización corneal de heridas, la angiogénesis, y linfangiogénesis también.

Se requiere que el epitelio de la córnea para mantener la claridad y la integridad de la córnea. Se renueva constantemente durante toda la vida de las células madre epiteliales que residen en el limbo-una zona estrecha en la unión de la córnea y la conjuntiva. Estas células madre limbares auto-renovación juegan un papel crucial en la regeneración del epitelio corneal, tanto normalmente y después de la lesión. agotamiento parcial o completa de estas células madre dará lugar a erosiones corneales recurrentes, dolor, cicatrización de la córnea y la neovascularización, la apariencia de las células caliciformes, y si se deja sin tratar la ceguera, la córnea. Esta condición se conoce como insuficiencia límbica (SIL) y puede ser idiopática; hereditario; o adquirida debido a las lesiones químicas o térmicas, lentes de contacto a largo plazo desgaste, y la inflamación crónica 1-6. La investigación sobre SIL requiere un modelo animal adecuado que no sólo imita la enfermedad en los seres humanos, pero es reproducible y sostenible, con el mínimo de unamonte de lesiones en otras estructuras de la córnea y oculares. Este modelo es necesaria para evaluar los tratamientos y para aclarar los mecanismos de la enfermedad a nivel molecular y celular. Como se ha descrito antes de 1, con el uso de una fresa giratoria, se puede desarrollar fácilmente un modelo de ratón de LSCD que cuenta con las ventajas antes mencionadas y persiste durante al menos tres meses. El objetivo de este estudio es presentar un modelo simple, reproducible y sostenible del ratón de SIL. La fresa de rotación es una práctica herramienta que elimina de manera uniforme el epitelio sin dañar el estroma subyacente 1. Se ha utilizado para inducir la erosión corneal central 7, 8 en los estudios de cicatrización de heridas. La técnica de la presente-presentado para crear LSCD en un ratón no se ha informado antes. Anteriormente introducido métodos de raspar el epitelio con un resultado espátula roma en una lesión menos uniforme, particularmente en el limbo y un fenotipo más variable 1, 9, con más o restauraciónf epitelio corneal normal de 1. A diferencia del raspador romo, la rebaba giratorio elimina la membrana basal epitelial, así 7, 8, 10. Otros métodos reportados por separar las células madre implican el uso de productos químicos, tales como hidróxido de sodio, n-heptanol, y cloruro de benzalconio, que no sólo puede inducir lesión no deseado a las estructuras del ojo subyacentes, sino que también puede conducir a la inflamación significativa y posterior opacificación corneal o epitelial metaplasia escamosa 11-15. La rebaba de rotación no está asociado con estas complicaciones graves. La extirpación quirúrgica del epitelio limbal, solo o con el uso de productos químicos 10, 11, 16, es más difícil de realizar y no es la mejor opción en los animales con ojos pequeños y una epitelio limbar delgada (como ratones). Además, sorprendentemente, limbectomy todavía puede dejar un poco del epitelio limbal detrás 10. La técnica descrita a continuación resultará en LSCD con una neovascularizaciónd conjuntivalización que imita la presentación del SIL completa en los pacientes y tiene una duración de al menos tres meses 1. Es adecuado para aquellos que tienen como objetivo estudiar la fisiopatología SIL o la cicatrización de heridas, la inmunología, y los tratamientos potenciales en ratones. Posiblemente, con algunas modificaciones, este procedimiento puede llevarse a cabo en ratas o conejos 10. Como la rebaba giratorio elimina eficazmente el epitelio, que se puede utilizar en cualquier investigación perteneciente a la abrasión corneal epitelial / herida y en cualquier tratamiento relacionado o estudios de biología molecular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Rumex International Co, Clearwater, FL</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 16-141</td>
			<td style="width:351px;">0.5 mm burr. Also available from other companies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Surgical microscope</td>
			<td style="width:277px;">Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Wild M691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Digital camera</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Thailand</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Nikon FS-2 slit lamp</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Polyclonal anti-CK12 antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz Blotechnology, CA,</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; SC-17101</td>
			<td>1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Monoclonal anti-CK8 antibody</td>
			<td style="width:277px;">TROMA-I-s, Iowa City, IA</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; AB_531826</td>
			<td>1:50 concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

insuficiencia límbica (SIL) es un estado de mal funcionamiento o pérdida de las células madre epiteliales del limbo, después de lo cual el epitelio corneal se reemplaza con la conjuntiva. Los pacientes que sufren de defectos corneales recurrentes, dolor, inflamación y pérdida de la visión. Anteriormente, se ha descrito un modelo murino de SIL y se comparó con otros dos modelos. El objetivo era producir un modelo de ratón consistente de SIL que tanto imita el fenotipo en los seres humanos y dura el tiempo suficiente para que sea posible estudiar la fisiopatología de la enfermedad y evaluar nuevos tratamientos. Aquí, la técnica se describe en más detalle. Una herramienta motorizada con una fresa rotativa ha sido diseñado para eliminar los anillos de óxido de la superficie de la córnea o para alisar la cama pterigión en los pacientes. Es un dispositivo adecuado para crear el modelo SIL deseado. Se trata de una herramienta de fácil de usar fácilmente disponible con una punta fina que la hace apropiada para trabajar en pequeños ojos, comoen ratones. Su aplicación evita trauma innecesario a la vista y que no da lugar a lesiones no deseados, como a menudo es el caso de modelos de lesión química. A diferencia de un raspador romo, que elimina el epitelio con la membrana basal. En este protocolo, la zona del limbo fue pulida dos veces, y luego todo el epitelio corneal se afeitó de limbo a limbo. Para evitar lesiones estroma, se tuvo cuidado de no rozar la superficie de la córnea una vez que el epitelio ya se había eliminado.

Dentro de un mes después de realizar esta técnica, el 100% de las corneas desarrolló neovascularización superficial (Figura 1A. Las fotografías fueron tomadas con una cámara conectada a una lámpara de hendidura bajo un campo brillante y cobalto filtro azul). En 18/20 (90%) de los ojos, la neovascularización implicada toda la superficie corneal (Figura 1A). En 2/20 (10%), se observó neovascularización en tres de los cuatro cuadrantes de la córnea, pero aún alcanzó el centro de la córnea. Para validar el desarrollo de SIL, toda la inmunotinción se realizó montaje 1. Este paso no es una parte del protocolo y puede ser alterado en función de los objetivos e intereses. Tres variaciones se consideran como indicadores de LSCD: ausencia de citoqueratina (CK) 12, un filamento intermedio específico para células epiteliales corneales normales 17, 18; aparición de CK8, un simple marcador de epitelios <shasta&gt; 20 que no está presente en la córnea normal; y la presencia de células caliciformes en la superficie corneal. Para evaluar el fenotipo epitelial corneal, doble inmunotinción de CK12 y CK8 se realizó en muestras de todo el montaje de tres meses después de la lesión, como se describió anteriormente 1, 9. Existencia de células caliciformes fue evaluada por MUC5AC-de copa celda específica mucina-inmunotinción 1, 15, 19 45 días después de la extracción epitelial. La aparición de células caliciformes reduce en el tiempo. Para obtener los mejores resultados, es importante llevar a cabo la coloración menos de dos meses después de la lesión. Córneas normales no lesionadas, expresa CK12-un marcador específico de las células epiteliales de la córnea maduras 17, 18 -A lo largo de la superficie de la córnea, pero que carezcan de CK8 o células caliciformes (MUC5AC) por parte de la córnea de todo el montaje muestras (Figura 1B) . En comparación con los ojos normales, la expresión de CK12 está casi ausente en injur<html> Y córneas modelo, mientras que muestran significativamente tinción positiva para CK8 y células caliciformes (Figura 1B). Estas observaciones indican el desarrollo de LSCD. Si está interesado en la cuantificación de los resultados de inmunotinción, utilice la imagen-J para cuantificar por separado 20 densidades de inmunotinción en las imágenes originales, sin alterar tomadas por el microscopio bajo los mismos parámetros. En pocas palabras, seleccionar la parte de la córnea de la muestra de montaje, medir la densidad y el área integrada para esa región, y calcular la densidad corregida por el fondo 20. La relación de CK12 a densidades Ck8 se presentaron anteriormente en un mayor número de muestras 1. La relación reducida en comparación con los controles (córneas normales) y la aparición de células caliciformes en la superficie corneal demuestran el desarrollo de LSCD. 658 / 54658fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Fenotipo de la córnea después de crear SIL en ratones. Examen con lámpara de hendidura muestra que todas las córneas desarrollan algún grado de neovascularización en un mes (A, barra de escala: 0,5 mm). Una córnea normal expresa CK12 todo la córnea, pero está desprovisto de cualquier CK8 o células caliciformes (MUC5AC). CK12 está ausente en el modelo SIL, mientras CK8 y células caliciformes aparecen en la córnea (B, barra de escala: 200 micras). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54658/54658fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K vistas.  University of Illinois at Chicago.  El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo. 

Video: A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modelo de ratón En el útero Trasplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Investigación

Medicina

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

Parabiosis en ratones: un protocolo detallado

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Un procedimiento quirúrgico para resecar la costilla del ratón: un modelo a gran escala Reparación huesos largos

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Un dispositivo sencillo de preparar rápidamente enteros Montes del Intestino Ratón

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

La interposición de la vena del modelo: un modelo adecuado para estudiar la permeabilidad del injerto de bypass

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Entrega intranasal de células madre terapéuticas a glioblastoma en un modelo de ratón

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...