חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

פגיעה בסטרומה הקרנית הבוגרת מובילה לתגובה מהירה לריפוי פצעים הפוגעת בראייה של האדם עקב היווצרות רקמת צלקת אטומה. פרוטוקול זה יוצר פצעים בקרניות אפרוח עובריות שבניגוד למבוגרים, יכולות להחלים ללא צלקת. בהתחשב ביכולת הפנימית של הקרנית העוברית הפגועה לעבור שחזור מלא של מבנה הקרנית המקומי ללא הצטלקות הניתנת לזיהוי, הגוזל העוברי משמש מודל חייתי חשוב להבהרת הגורמים המולקולריים והתאיים לריפוי פצעי הקרנית ללא צלקות.

ההיבט המאתגר ביותר של טכניקה זו הוא יצירת פצע עקבי החודר הן לאפיתל החיצוני ביותר והן לסטרומה הקרנית העמוקה יותר. כפי שלומדים, ייתכן שיהיה מועיל לראות את הקרניות הפצועות בחתך רוחב, כך שניתן יהיה להעריך את עומק חדירת הפצע לסטרומה הקרנית. כדי להתחיל, לסדר את הביצים אופקית על מגש ולסמן אותם בחלק העליון של הביצית כדי לציין את המיקום הצפוי של העובר.

דגירה של ביצים אלה באינקובטור לח של 38 מעלות צלזיוס עם פונקציית הנדנדה מופעלת. מוציאים את הביצית מהחממה ביום השלישי להתפתחות העוברית וממקמים אותה אופקית במחזיק ביצית מאובטחת. צור חור קטן בחלק העליון של קליפת הביצה ליד הקצה המחודד של הביצה באמצעות הקצה החד של ניתוח מספריים.

הכנס מחט היפודרמית משופעת של 18 מדים דרך החור. כאשר המחט נדחפת לתחתית המשטח הפנימי של הביצה והצד המשופע של המחט פונה לקצה המחודד של הביצה, מוציאים שניים עד שלושה מיליליטרים של האלבומין מביצת התרנגולת ומשליכים. נקו את משטח קליפת הביצה המקיף את החור במגבונים נטולי מוך, לחים קלות עם 70% אתנול ונגבו יבשים.

אוטמים את החור שנועד להסרת אלבומין עם קלטת שקופה. עם הקצה החד של ניתוח מספריים, לעשות חור חלון שני בחלק העליון של קליפת הביצה. יש לוודא שהמספריים אינם מתרחבים רחוק מדי לתוך קליפת הביצית כדי להימנע ממגע ופגיעה בעובר או בכלי הדם העובריים הממוקמים ישירות מתחת לצד החור השני.

באמצעות מלקחיים מעוקלים, הרחיבו את חור החלון כך שיתפרש על פני קוטר של כשני עד שלושה סנטימטרים כדי לחשוף ולקבל גישה לעובר המתפתח שמתחת לקליפה. כעת, הכניסו קצה אחד של המלקחיים לתוך החור, תוך שמירה עליו מקביל לקליפת הביצה וצמוד אליה. כאשר קצה המלקחיים האחרים ממוקם מחוץ לקליפת הביצה, צובטים בזהירות את שני קצוות המלקחיים יחד, ומאפשרים להם להישבר ולהסיר חתיכות קטנות מקליפת הביצה.

ממשיכים לשבור ולהסיר שברי קליפות ביצים עד שנשאר חלון של שניים עד שלושה סנטימטרים שמכסה ישירות את העובר. כדי להגביל את הזיהום החיידקי, הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטרים של תמיסת צלצול המכילה 50 יחידות למיליליטר של פניצילין ו-50 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין דרך חור החלון. אטמו את חור החלון באמצעות סרט דבק שקוף.

בצע את איטום הביצה על ידי יישור פינה של הסרט על הציר הארוך של החור ולחיצה על הקלטת לקליפה במרחק של סנטימטר עד שני סנטימטרים מקצה החור. ממשיכים לאטום סביב הפתח עד שנשאר דש תלוי של סרט הדבקה בצד אחד. לחצו על שתי פיסות הקלטת זו לזו, ויצרו צורה כיפה מעל החור ולחצו על דש הסרט התלוי אל הקליפה כדי לסיים את איטום הביצה.

מחזירים את הביצים החלונות לאינקובטור להמשך פיתוח. הקפידו לשמור על ביצים אלה אופקיות ולכבות את תפקוד הנדנדה של האינקובטורים. השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שהעובר נמצא בשלב ההתפתחותי הנכון ולאתר את מיקומם של הממברנה השפירית והממברנה הכוריואלנטואית.

לאחר מכן השתמש במספריים מעוקרים של מיקרו-ניתוח כדי לחתוך חור בקרום השפיר ישירות מעל הפורלימב המשתרע מהממברנה, ומעל הממברנה אל הממברנה שמעל הראש. השתמשו בשני זוגות של מלקחיים סטריליים עדינים ותפסו בעדינות את השמניון בשתי תנוחות סמוכות בין קרום השפיר ACM לבין הממברנה הכוריו-אלנטואית. הזיזו בזהירות כל זוג מלקחיים, שניהם אוחזים בחוזקה בקרום מי השפיר, הרחק זה מזה כאשר זוג אחד נע באופן דורסני אל העובר והשני אל הגחון.

השתמש במלקחיים עדינים מעוקרים כדי לנתח ולהסיר את כל קרום השן שנותר המכסה את העובר. באמצעות מלקחיים מעוקרים, תפסו את האניון ליד אזור הגולגולת האמצעי של העובר ומשכו בזהירות את השן בכיוון בקלה ביחס לעובר לכיוון הקרום הכוריואלנטואי שנעקר מוקדם יותר. אטמו מחדש את חור החלון באמצעות סרט שקוף כמתואר בכתב היד והחזירו את הביצה לחממה להמשך פיתוח.

ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש את הקרומים העובריים הנוספים כדי להבטיח שהעין הימנית נגישה. אם העין הימנית אינה נגישה לפציעה בשל מיקום העובר בביצה, היא יכולה לשמש כבקרה שאינה פצועה. השתמשו בסכין מיקרו-ניתוח כדי ליצור חתך המשתרע על פני היקף הקרנית של עין ימין אשר מקבילה לרקמת הכורואידים ובשורה אחת איתה.

השתמש בסכין ניתוח המיקרו כדי לשוב, לחתוך את הקרנית באותה נקודה כמו החתך הראשון, פי שניים יותר באופן כזה שחתך שניים וחתך שלוש מתרחש יחד עם אותה תנוחה בקרנית כמו לחתוך אחד. כדי לסייע בכדאיות, השתמש במלקחי הקשתית המעוקלים כדי לתחוב את העובר בחזרה מתחת לממברנה הכוריואלנטואית לאחר הניתוח כדי לקדם צמיחה נכונה של הממברנה הכוריואלנטואית. לאחר מכן, מוסיפים שלוש עד ארבע טיפות של תמיסת צלצול המכילה אנטיביוטיקה כדי לייבש את העובר ולעקר את הביצית.

אטום מחדש את חור החלון בנייר דבק שקוף וחזור לחממה, תוך השארת הביצה אופקית. תנו לעובר להתפתח ולפצע הקרנית להחלים לתקופה הרצויה. לאחר הדגירה, המתים את העובר ומשתמשים במלקחיים מעוקלים של הקשתית כדי לקצור את העין בצלחת פטרי של תמיסת המלח של רינגר על ידי אחיזה עדינה של העין בצד האחורי שלה שבו העין ורקמת הפנים נפגשות ומרימים בזהירות את כל העין הרחק וללא רקמת הפנים.

השתמשו במלקחיים עדינים כדי לתקוע חור קטן של שלושה עד חמישה סנטימטרים בחלק האחורי של העין כולה ולתקן את כל העין ב-4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס בלילה עם תסיסה קלה. כדי להשיג פצע אידיאלי, חשוב להשתמש בסכין מיקרו דיסקציה חדה ולהפעיל את כמות הלחץ הנכונה במהלך החתך. הפעלת לחץ נמוך מדי תגרום לפצע רדוד שקורע את אפיתל הקרנית מבלי לחדור מספיק לסטרומה הקדמית.

הפעלת לחץ רב מדי גורמת לפצע בהיקף מלא החודר לכל הסטרומה וחושף את ההומור המיימי לסביבה החיצונית. ביצוע החתכים המתאימים מייצר פצע אידיאלי שבתחילה מגדיל אפס לשלושה ימים לאחר הפציעה. לאחר מכן, אפיתליזציה מחדש ויצירת רקמות חדשות מתרחשת כדי בסופו של דבר לסגור את הפצע בצורה ללא צלקת על ידי 11 ימים, לאחר הפציעה.

לוקליזציה מרחבית-טמפורלית של חלבוני המטריצה החוץ-תאית, הפיברונקטין והטנאסין בתוך הפצע המרפא נמצאה כמוגבהה בנקודות זמן המתאימות לאפיתליזציה מחדש של הקרנית, מה שמרמז על מעורבותם בסגירת פצע, נדידת תאי אפיתל והישרדות. אימונוהיסטוכימיה של הר שלם גילתה כי העצבים שהצמידו ישירות את הקרנית המרכזית הפצועה מעוכבים באופן זמני מרקמת הקרנית המרפאת. למרות עיכוב מוקדם יותר, עצבי הקרנית בסופו של דבר מעצבנים את רקמת הקרנית שנרפאה לחלוטין 11 יום לאחר הפציעה לרמות צפיפות דומות ובדפוסים דומים לשלבים תואמים שאינם פצועים שולטים ביום העוברי 18.

כפי שמעידה הדמיה הרמונית מהדור השני, צרורות של סיבי קולגן בעומקים משתנים של פצע הקרנית המרכזית נראים מסודרים בצורה אורתוגונלית, התואמת את מבנה המאקרו הטבעי של רקמת הקרנית המרכזית שאינה פצועה. בשילוב עם גישות ביולוגיות התפתחותיות קלאסיות, כגון השתלת רקמות והשתלת חרוזים, כמו גם גישות מודרניות למניפולציה של גנים כגון זיהום רטרו-ויראלי ואלקטרופורציה של DNA, מודל חייתי זה מבטיח לחשוף גורמים מולקולריים ומנגנונים תאיים הדרושים לקידום ריפוי פצעי קרנית ללא צלקות. קביעת גורמים מולקולריים מרכזיים בחלבוני מטריצה המווסתים ריפוי פצעים ללא צלקות עובריות תסלול את הדרך לטיפולים המטפחים תהליך ריפוי משקם יותר עם פחות הצטלקות וסיכום טוב יותר של ארכיטקטורת הרקמה הנורמלית.