El objetivo general de este procedimiento es fabricar hidrogeles de micropatrones para estudios de microscopía de fuerza de tracción 2D. Esto se logra primero haciendo que una cubierta de vidrio metacrilado se deslice y formando la primera capa de un hidrogel de poliacrilamida sobre ella. El segundo paso es crear otra capa de hidrogel que contenga perlas fluorescentes para microscopía de fuerza de tracción.
El hidrogel se intercala con un deslizamiento de cubierta de micropatrones en la parte superior, lo que resulta en la transferencia de las proteínas de la matriz de micropatrones en la superficie del hidrogel. A continuación, se deja polimerizar el hidrogel de poliacrilamida a temperatura ambiente durante 45 minutos. El deslizamiento de la cubierta superior se retira con cuidado.
Las imágenes de microscopía de fluorescencia se utilizan para mostrar la presencia de las perlas y la transferencia exitosa de proteínas de la matriz extracelular micropatronadas. Este método ayuda a medir de manera eficiente y precisa varias fuerzas de tracción mediante el uso de la luz y la liberación de células. Posibilitando la obtención de un mayor número de observaciones experimentales a partir de una misma muestra.
Así que demostrando el procedimiento estará Joel Christian, un estudiante graduado de mi laboratorio. Agregue 10 mililitros de agua destilada doble en un vaso de precipitados. Después, agregue 18.75 mililitros de ácido acético, 18.75 mililitros de metacrilato de 3-propilo y 252.5 mililitros de etanol a la solución.
Cuando la solución esté completa, transfiérala a un plato cristalizante. Tome resbalones de cubierta redonda de 24 milímetros, límpielos con una toallita de precisión y colóquelos en un estante de teflón hecho a medida. Luego sumérjalo en la solución e incube durante 15 minutos.
Tome la rejilla y enjuáguela con etanol. Seque la cubierta bajo el flujo de aire. Los resbalones de cubierta metracrilados se pueden almacenar hasta un mes a temperatura ambiente.
Tome un resbalón de cubierta redonda de 15 milímetros y colóquelo en una placa de Petri. Use un bolígrafo de diamante para marcar el lado superior del resbalón de la cubierta. Luego proceda a la limpieza a través del tratamiento con plasma de oxígeno.
El resbalón de la cubierta está limpio a 0,4 milibares y 200 vatios durante dos minutos. Pipetear 100 microlitros de 0.01% de solución de Poli-L-Lisina sobre la superficie de la cubierta deslizante e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, lave el resbalón de la cubierta con 10 milimolares a un pH de 8.5.
Saque el exceso de líquido, pero mantenga la superficie húmeda. Pipetear 100 microlitros de 50 miligramos por mililitro de mPEG-SVA en solución de pH 8.5 10 milimolares sobre la superficie de la cubierta deslizante e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Después, enjuague los resbalones de la cubierta con pH 10 milimolar 8.5.
Luego agregue dos microlitros de gel PLPP seguidos de 40 microlitros de etanol en la superficie. Incline suavemente la placa de Petri para homogeneizar la solución. Espere cinco minutos para que la solución se polarize.
Coloque el resbalón de la cubierta dentro de una placa de Petri de orificio inferior de 35 milímetros. Coloque la placa de Petri que contiene el resbalón de la cubierta en el escenario del microscopio. Ajuste el enfoque en la superficie del vidrio.
Cargue y bloquee el patrón prediseñado. Comience el patrón por dosis UV de 30 milijulios por milímetro al cuadrado. Después de completar el paso de modelado, saque el deslizamiento de la cubierta del patrón y enjuague la superficie con PBS.
Incubar la muestra con una mezcla de 100 microlitros de 25 microgramos por mililitro de fibronectina y 25 microgramos por mililitro de fibrinógeno conjugado con Alexa 488 disuelto en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Para preparar el sustrato de hidrogeles, comience colocando el deslizamiento de la cubierta metacrilada en una placa de Petri. Para empezar, prepare una solución fresca de AgA oxidada agregando 9.55 mililitros de agua destilada doble en un tubo Falcon de 15 mililitros.
Luego agregue 0.5 mililitros de AgA. Luego agregue 42 miligramos de meta piruvato de sodio a la solución. Coloque la solución en el agitador durante cuatro horas.
Luego prepare la solución madre mezclando acrilamida, bisacrilamida y agua destilada doble de acuerdo con la Tabla 1. La solución de stock se puede mantener hasta por un año a cuatro grados centígrados. Prepare la solución de trabajo para la capa inferior mezclando 99.3 microlitros de solución madre con 0.5 microlitros de persulfato de amonio al 1% y 0.2 microlitros de TEMED.
Tome 10 microlitros de la solución y la pipeta en cuanto a gotas en el resbalón de la cubierta metacrilada. Coloque con cuidado un resbalón de cubierta redonda de 15 milímetros en la gota y espere 45 minutos para que se polimerice. A continuación, separe el deslizamiento de la cubierta superior con el bisturí.
Luego prepare la solución de trabajo para la capa superior mezclando 93.3 microlitros de solución madre con un HEA oxidado de microlitros, cinco perlas fluorescentes de microlitros, 0.5 microlitros de persulfato de amonio al 1% y 0.2 microlitros de TEMED. Tome cinco microlitros de la solución y pipetee en cuanto a gotas sobre el hidrogel de la capa inferior. Coloque con cuidado un resbalón de cubierta de micropatrones en la gota.
Espere 45 minutos para que se polimerice. Desmonte suavemente el resbalón de la cubierta con un bisturí. Y pegue el deslizamiento de la cubierta en la parte inferior de una placa de seis pocillos perforada a medida.
Agregue PBS a los pozos. Para ver las células, aspire el PBS desde la placa de seis pocillos. Para los fibroblastos, agregue DMEM de glucosa alta que contenga L-glutamina y suplementarlo con 10% FPS y 1% de penicilina y estreptomicina.
Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Encienda el CO2 y el calentamiento para la etapa de microscopía. Luego encienda el microscopio y coloque la placa del pozo en el escenario.
Configure el patrón de iluminación y marque las celdas de interés. Vuelva a enfocar en la superficie del hidrogel. Adquirir la imagen de las células en el canal de campo brillante.
Para tomar la imagen de las cuentas en el estado deformado, cambie al canal. Luego cambie al canal láser e ilumine la celda de acuerdo con el patrón durante tres minutos. Esto corresponde a una dosis de 6,000 milijulios por milímetro al cuadrado.
Después, cambie el canal y adquiera la imagen de las cuentas en el estado no deformado. Para calcular las fuerzas de tracción, abra las imágenes de cuentas fluorescentes que ya corrigieron la deriva lateral. El análisis completo de las fuerzas de tracción se detalla en el guión adjunto.
Para verificar la adhesión selectiva de las células a las regiones micropatronadas en la superficie de los hidrogeles, se tomaron imágenes de muestras con microscopía fluorescente utilizando proteínas de matriz premarcadas y con microscopía de campo brillante para visualizar las células. Las propiedades mecánicas de los hidrogeles de poliacrilamida se variaron mezclando diferentes cantidades de acrilamida y bisacrilamida. La rigidez del hidrogel se evaluó con experimentos de nanoindentación mediante microscopía de fuerza atómica.
Las mediciones de la fuerza de tracción se realizaron después de aplicar una iluminación de rayo láser ultravioleta espacial, controlada temporalmente, para iluminar selectivamente regiones de tamaño micrométrico del hidrogel de poliacrilamida. Las fuerzas de tracción se reconstruyeron mediante el uso de FTTC regularizado con un parámetro de regularización elegido por validación cruzada generalizada. Nuestro enfoque modular de modelo basado en la microscopía de fuerza de atracción combinada con la liberación de luz y uso de células de micropatrones es versátil y podría explotarse aún más con otras microscopías y configuraciones de imágenes para mejorar su resolución y sensibilidad.
