الهدف العام لهذا الإجراء هو تصنيع الهيدروجيلات الدقيقة النقش لدراسات المجهر قوة الجر 2D. ويتم ذلك أولا عن طريق جعل زلة غطاء زجاجي ميثاكريلاتيد وتشكيل الطبقة الأولى من هيدروجيل البولي أكريلاميد على ذلك. الخطوة الثانية هي إنشاء طبقة هيدروجيل أخرى تحتوي على حبات فلورية للفحص المجهري لقوة الجر.
يقع الهيدروجيل مع زلة غطاء نمط صغير فوقه ، مما يؤدي إلى نقل بروتينات مصفوفة النمط الدقيق على سطح الهيدروجيل. بعد ذلك ، يتم ترك هيدروجيل البولي أكريلاميد للبوليمرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. ثم تتم إزالة زلة الغطاء العلوي بعناية.
يستخدم التصوير المجهري الفلوري لإظهار وجود الخرز والنقل الناجح لبروتينات المصفوفة خارج الخلية المنقوشة الدقيقة. تساعد هذه الطريقة على قياس العديد من قوى الجر بكفاءة ودقة باستخدام الضوء واستخدام إطلاق الخلايا. مما يجعل من الممكن الحصول على عدد أكبر من المراقبة التجريبية من نفس العينة.
لذا إثبات الإجراء سيكون جويل كريستيان، طالب دراسات عليا من مختبري. أضف 10 ملليلترات من الماء المقطر المزدوج إلى كوب. بعد, إضافة 18.75 ملليلتر من حمض الخليك, 18.75 ملليلتر من 3-بروبيل ميثاكريلات و 252.5 ملليلتر من الإيثانول إلى الحل.
عندما يكتمل الحل، قم بنقله إلى طبق بلوري. خذ 24 ملليمترا من قسائم الغطاء المستدير، وانظفها بمسح دقيق، ووضعها في رف تفلون مخصص. ثم تزج في الحل واحتضان لمدة 15 دقيقة.
خذ الحامل وشطفه بالإيثانول. جفف الغطاء ينزلق تحت تدفق الهواء. يمكن تخزين قسائم الغطاء الميثاكريلاتية لمدة تصل إلى شهر واحد في درجة حرارة الغرفة.
خذ زلة غطاء دائرية عيار 15 ملليمتر ووضعها على طبق بيتري. استخدم قلم ألماس لوضع علامة على الجانب العلوي من قسيمة الغطاء. ثم انتقل إلى التنظيف عن طريق علاج بلازما الأكسجين.
زلة الغطاء نظيفة في 0.4 ملليبار و 200 واط لمدة دقيقتين. ماصة 100 ميكرولتر من 0.01٪ من محلول بولي-إل-ليسين على سطح الغطاء زلة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الغطاء ب 10 ملليمولار عند رقم PH 8.5.
إخراج السائل الزائد، ولكن الحفاظ على السطح الرطب. ماصة 100 ميكرولتر من 50 ملليغرام لكل ملليلتر من mPEG-SVA في 10 ملليمولار درجة الحموضة 8.5 الحل على سطح زلة الغطاء واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، شطف الغطاء زلات مع 10 ملليمولار الحموضة 8.5.
ثم أضف اثنين من ميكرولتر من هلام PLPP تليها 40 ميكرولتر من الإيثانول على السطح. إمالة بلطف طبق بيتري لتجانس الحل. انتظر لمدة خمس دقائق للحل للاستقطاب.
ضع الغطاء ينزلق داخل حفرة أسفل 35 ملليمتر طبق بيتري. وضع طبق بيتري التي تحتوي على زلة الغطاء على خشبة المسرح المجهر. ضبط التركيز على سطح الزجاج.
تحميل وقفل نمط مرسومة مسبقا. بدء النقش بجرعة الأشعة فوق البنفسجية من 30 ملليجول لكل ملليمتر مربع. بعد الانتهاء من خطوة النقش، أخرج زلة غطاء النمط وشطف السطح مع برنامج تلفزيوني.
احتضان العينة مع خليط 100 ميكرولتر من 25 ميكروغرام لكل فيبروكتين ملليلتر و 25 ميكروغرام لكل ملليلتر الفيبرينوجين المترافق مع اليكسا 488 حل في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لإعداد ركيزة الهيدروجيل، ابدأ بوضع الغطاء الميثاكريلاتي في طبق بيتري. للبدء، قم بإعداد محلول AgA المؤأكسد الطازج بإضافة 9.55 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج إلى أنبوب فالكون 15 ملليلتر.
ثم أضف 0.5 ملليلتر من AgA. ثم أضف 42 ملليغرام من الصوديوم ميتا بيروفاتي إلى الحل. وضع الحل على شاكر لمدة أربع ساعات.
ثم إعداد محلول المخزون عن طريق خلط الأكريلاميد، بيس أكريلاميد، والمياه المقطرة مزدوجة وفقا للجدول 1. يمكن الاحتفاظ بحل المخزون لمدة تصل إلى عام عند أربع درجات مئوية. إعداد حل العمل للطبقة السفلية عن طريق خلط 99.3 ميكرولتر من محلول المخزون مع 0.5 ميكرولتر من كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.2 ميكرولتر من TEMED.
خذ 10 ميكرولتر من الحل وماصة قطرة الحكمة على زلة غطاء الميثاكريلاتي. ضع بعناية زلة غطاء دائري من عيار 15 ملليمترا على القطرة وانتظر 45 دقيقة حتى يبوليمر. بعد ذلك، افصل زلة الغطاء العلوي بالمشرط.
ثم إعداد حل العمل للطبقة العليا عن طريق خلط 93.3 ميكرولتر من محلول المخزون مع واحد MICROLITER مؤأكسدة HEA، خمسة حبات الفلورسنت ميكرولتر، 0.5 ميكرولتر من كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.2 ميكرولتر من TEMED. اتخاذ خمسة ميكرولتر من الحل وماصة انها قطرة الحكمة على هيدروجيل الطبقة السفلى. ضع بعناية زلة غطاء نمط صغير على القطيرات.
انتظر 45 دقيقة حتى يبوليمر. فصل بلطف زلة الغطاء مع مشرط. والغراء الغطاء زلة على الجزء السفلي من لوحة مخصصة حفر ستة آبار.
إضافة برنامج تلفزيوني إلى الآبار. لرؤية الخلايا، يستنشق برنامج تلفزيوني من لوحة من ستة آبار. بالنسبة للخلايا الليفية، أضف نسبة عالية من الجلوكوز DMEM تحتوي على L-glutamine وتكملها ب 10٪ FPS و1٪ بنسلين وستريبتومايسين.
احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تشغيل ثاني أكسيد الكربون والتدفئة لمرحلة المجهر. ثم قم بتشغيل المجهر ووضع لوحة البئر على المسرح.
إعداد نمط الإضاءة ووضع علامة على الخلايا ذات الاهتمام. إعادة التركيز على سطح الهيدروجيل. الحصول على صورة الخلايا في قناة برايتفيلد.
لالتقاط صورة الخرز في الحالة المشوهة، انتقل إلى القناة. ثم التبديل إلى قناة الليزر وإلقاء الضوء على الخلية وفقا لنمط لمدة ثلاث دقائق. وهذا يتوافق مع جرعة من 6000 ملليجول لكل ملليمتر مربع.
بعد ذلك، قم بتبديل القناة والحصول على صورة الخرز في الحالة غير المتشكلة. لحساب قوى الجر، افتح صور حبة الفلورسنت التي تم تصحيحها بالفعل للانجراف الجانبي. يتم تفصيل التحليل الكامل لقوى الجر في النص المرفق.
وللتحقق من التصاق الخلايا الانتقائي بالمناطق المنقوشة على سطح الهيدروجيلات، صورت العينات بالمنظار المجهري الفلوري باستخدام بروتينات مصفوفة تحمل علامات مسبقة وبمنظار دقيق من برايتفيلد لتصور الخلايا. وتباينت الخصائص الميكانيكية للهيدروجيلات البولي أكريلاميد عن طريق خلط كميات مختلفة من الأكريلاميد والبيس أكريلاميد. تم تقييم صلابة الهيدروجيل مع تجارب المسافات البادئة النانوية عن طريق المجهر القوة الذرية.
وأجريت قياسات قوة الجر بعد تطبيق المكانية، التي تسيطر عليها زمنيا، والإضاءة شعاع الليزر فوق البنفسجي لإلقاء الضوء بشكل انتقائي مناطق بحجم ميكرون من هيدروجيل البولي أكريلاميد. وأعيد بناء قوى الجر باستخدام نظامية FTTC مع معلمة تنظيم اختارها التحقق من صحة الصليب المعمم. نهجنا وحدات نموذج على أساس المجهر قوة الجذب جنبا إلى جنب مع الضوء واستخدام الإفراج عن الخلايا الصغيرة نمط متعدد الاستخدامات ويمكن أن تستخدم أكثر مع المجهر الأخرى وإعداد التصوير لتحسين دقتها وحساسيتها.
