Este protocolo utiliza la automatización para realizar preparaciones de bioquímica de proteínas antes de los experimentos de espectrometría de masas, lo que permite un mayor rendimiento y una menor variabilidad para los estudios proteómicos. Este protocolo utiliza un sistema de manejo de líquidos programable y de bajo costo que es asequible para más laboratorios. Proporcionamos scripts Python de código abierto que se pueden modificar para un mayor desarrollo.
Demostrando el procedimiento estará Milton Amaya, un estudiante de maestría en nuestro laboratorio. Para comenzar, abra el noSP3_Digestion. py script en el editor de texto y especifique las variables específicas del experimento según sea necesario en la sección PERSONALIZAR SOLO AQUÍ.
Luego, abra la aplicación Opentrons y cargue el script en la pestaña Protocolo en la aplicación Opentrons. A continuación, coloque el material de laboratorio y las pipetas necesarios en la ubicación correspondiente en la plataforma OT2 especificada en el script de Python. Luego, coloque la solución de bicarbonato de amonio en el pozo A1 del estante de tubos cuatro en uno con la parte superior del soporte de tubo de 15 mililitros más 50 mililitros y coloque la muestra de proteína en el pozo A1 del estante de tubos cuatro en uno con una tapa de soporte de tubo de dos mililitros.
Coloque manualmente tubos de baja unión de proteína de dos mililitros en los pocillos del bloque de aluminio colocado en la parte superior del módulo de temperatura, comenzando desde A1 y moviéndose hacia abajo verticalmente. A continuación, coloque la solución de TDT en el pozo A6 del bastidor de tubos cuatro en uno con una tapa de soporte de tubo de dos mililitros. Observe mientras el robot transfiere un volumen apropiado del tampón de bicarbonato de amonio a los tubos de muestra en el bloque de aluminio.
Luego, verifique manualmente que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de que la TDT se haya cargado en A6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo. Después de confirmar la ubicación del tubo de TDT y abrir la tapa del tubo, haga clic en el botón Reanudar en la aplicación Opentrons para continuar. Asegúrese de que el robot transfiera 10 microlitros de la solución de TDT a cada pozo de muestra, seguido de cinco rondas de mezcla.
A continuación, verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de cerrar las tapas de los tubos de muestra. Luego, cierre manualmente las tapas de los tubos y haga clic en Reanudar para continuar. Espere hasta que el módulo de temperatura del robot comience a calentar el bloque de aluminio y la temperatura alcance los 55 grados centígrados, seguida de una incubación de cinco minutos para permitir que las muestras lleguen a 55 grados centígrados.
El robot mantendrá esta temperatura durante 30 minutos para permitir la reducción de proteínas mediante TDT. Durante la incubación, prepare la solución de yodoacetamida y envuélvala manualmente con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Después de la incubación, cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje de advertencia, asegúrese de abrir las tapas en los tubos de muestra, destapar los tubos de muestra y haga clic en Reanudar para continuar.
A continuación, verifique manualmente que el programa del robot esté en pausa con el mensaje de advertencia, Asegúrese de que la yodoacetamida se haya cargado en B6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo. Después de confirmar la ubicación del bastidor del tubo de yodoacetamida y abrir la tapa del tubo, haga clic en Reanudar y asegúrese de que el robot transfiera 10 microlitros de la solución de yodoacetamida a cada tubo de muestra, seguido de cinco rondas de mezcla. Cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje, cierre las tapas de los tubos de muestra, cubra los tubos de muestra y cúbralos con papel de aluminio, luego cubra todo el bloque de aluminio con un trozo limpio de papel de aluminio y haga clic en Reanudar para continuar.
Espere hasta que las muestras se incuben a 22 grados centígrados durante 30 minutos y asegúrese de que el módulo de temperatura del robot se desactive al finalizar la incubación de yodoacetamida. Cuando el programa del robot está en pausa y muestra el mensaje de advertencia, asegúrese de que la tripsina se haya cargado en C6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo, coloque la solución de tripsina en el pozo C6 del bastidor de tubos de dos mililitros con la tapa del tubo abierta y haga clic en Reanudar para continuar. Luego, cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje de advertencia, abra las tapas en los tubos de muestra en el módulo de temperatura, desmarque los tubos de muestra y haga clic en Reanudar para continuar.
Espera mientras el robot transfiere 10 microlitros de tripsina a cada tubo de muestra, seguido de cinco rondas de mezcla. Después de la digestión de tripsina durante la noche, gire brevemente las muestras con una microcentrífuga de sobremesa y coloque las muestras en un estante de tubos magnéticos. Después de dos minutos, transfiera el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta a un nuevo conjunto de tubos de microcentrífuga de baja unión de proteínas y guarde las muestras en un refrigerador.
A continuación, abra el SP3_peptide_cleanup. py Python script en un editor de texto, y especifique las variables de experimento según sea necesario en la sección PERSONALIZAR AQUÍ SOLAMENTE. A continuación, cargue el script en la pestaña Protocolo de la aplicación Opentrons.
Coloque el material de laboratorio y las pipetas necesarios en la ubicación correspondiente en la plataforma OT2 especificada en el script de Python, y asegúrese de que el módulo magnético esté encendido y conectado al robot. Coloque una nueva placa de pozo de dos mililitros y 96 pocillos de profundidad en la parte superior del módulo magnético. A continuación, coloque las muestras digeridas en el bastidor de tubos de dos mililitros a partir de A1 y moviéndose hacia abajo verticalmente.
Luego, asegúrese de que el robot transfiera 55 microlitros de las muestras digeridas a los pozos en las placas de pozos profundos en el módulo magnético. Verifique que el protocolo del robot esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de que las cuentas preparadas se hayan cargado en A6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo. Luego, vórtice y gire brevemente las cuentas SP3 en una mini centrífuga de sobremesa y colóquelas en el pozo A6 del bastidor de tubos de dos mililitros con la tapa abierta.
Verifique que el programa de robots esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de que se haya cargado un 80% de etanol en A4 del bastidor de tubos de 15 mililitros más 50 mililitros ubicado en la ranura cinco antes de reanudar el protocolo. Luego, coloque una solución de etanol al 80% en el pozo A4 en el estante de tubos y haga clic en Reanudar para continuar. Observe mientras el robot cambia la velocidad de pipeteo a lenta, aspira el sobrenadante de cada pozo y lo dispensa en el tubo de desecho.
Espere hasta que el robot cambie la velocidad de pipeteo a la predeterminada y desconecte el módulo magnético. Cuando el programa de robots esté en pausa y muestre el mensaje, Abra la tapa en el tubo de bicarbonato de amonio, abra la tapa de la solución de bicarbonato de amonio, luego haga clic en Reanudar para continuar. Espera mientras el robot desconecta el módulo magnético, transfiere 250 microlitros del tampón de bicarbonato de amonio a cada pozo y se mezcla inmediatamente 10 veces.
Luego, observe mientras el robot cambia la velocidad de pipeteo a lenta y transfiere el sobrenadante de cada pozo al tubo de desecho. Espere hasta que el robot transfiera 100 microlitros del tampón de bicarbonato de amonio a cada pozo e inmediatamente mezcle 10 veces. Verifique que el programa de robots esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de que se hayan colocado nuevos tubos de recolección en el bloque de aluminio de dos mililitros antes de reanudar el protocolo.
Luego, coloque un nuevo conjunto de tubos de microcentrífuga de baja retención de proteínas en el bloque de aluminio inmediatamente después del último tubo de muestra inicialmente en el bloque, y haga clic en Reanudar para continuar. Espera mientras el robot transfiere cada muestra en el tampón de bicarbonato de amonio a los nuevos tubos de dos mililitros. Cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje, asegúrese de que la tripsina se haya cargado en C6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo, coloque la solución de tripsina en el pozo C6 del bastidor de tubos de dos mililitros con la tapa del tubo abierta y haga clic en Reanudar para continuar.
Una vez que el programa haya terminado de ejecutarse, envuelva las tapas del tubo de muestra con una película de parafina, transfiera todas las muestras a un mezclador con temperatura controlada e incube a 37 grados Celsius durante 16 a 20 horas con agitación de 1, 000 RPM. Con la muestra de BSA, se identificó un medio de 728 coincidencias de espectro peptídico y 65 péptidos, con coeficientes de variación de 5,2% y 3,2%, respectivamente. Con una muestra de corazón compleja, se identificó un medio de 9, 526 coincidencias de espectro peptídico, 7, 558 péptidos y 1, 336 proteínas en 10 tiradas con coeficientes de variación de 7.6% 5.9% y 3.6%, respectivamente.
Para determinar la variabilidad en la cuantificación de péptidos, se calcularon los coeficientes de variación de las intensidades del cromatograma iónico extraído para 10 péptidos que se asignan a una proteína única. Cuando las variabilidades de los resultados experimentales de humanos versus robots en la medición de la concentración de proteínas se compararon aún más con el ensayo de BCA, el coeficiente promedio de variación del ensayo de BCA de robot fue menor que el ensayo de BCA manual humano. Este protocolo reduce el tiempo de banco para procesar cada muestra.
Nos allana el camino para explorar las diferencias proteómicas en un panel de líneas celulares entre múltiples tratamientos farmacológicos.
