Shotgun 蛋白质组学 样品处理 由开源实验室机器人自动执行

该协议使用自动化在质谱实验之前执行蛋白质生物化学制备，从而为蛋白质组学研究提供更高的通量和更低的变异性。该协议使用低成本，可编程的液体处理系统，这是更多实验室负担得起的。我们提供开源 Python 脚本，可以对其进行修改以进行进一步开发。

演示该过程的将是Milton Amaya，我们实验室的硕士生。首先，打开noSP3_Digestion。在文本编辑器中编写 py 脚本，并在"仅在此处自定义"部分中根据需要指定特定于实验的变量。

然后，打开 Opentrons 应用程序并将脚本上传到 Opentrons 应用程序中的"协议"选项卡。接下来，将所需的实验室器具和移液器放在Python脚本中指定的OT2甲板中的相应位置。然后，将碳酸氢铵溶液置于具有15毫升加50毫升管架顶部的四合一管架的A1孔中，并将蛋白质样品置于具有两毫升管架顶部的四合一管架的A1孔中。

手动将两毫升蛋白质低结合管置于温度模块顶部的铝块孔中，从A1开始垂直向下移动。然后，将DTT溶液放在四合一管架的A6孔中，顶部有一个两毫升的管架。观察机器人将适当体积的碳酸氢铵缓冲液转移到铝块中的样品管中。

然后，手动验证机器人程序是否已暂停并显示消息，确保DTT已加载到位于插槽4中的两毫升管架的A6中，然后再恢复协议。确认DTT管的位置并打开管盖后，单击Opentrons应用程序中的"恢复"按钮以继续。确保机器人将10微升的DTT溶液转移到每个样品孔中，然后进行五轮混合。

接下来，验证机器人程序是否已暂停并显示消息，确保关闭样品管上的盖子。然后，手动关闭管的盖子，然后单击"恢复"以继续。等到机器人的温度模块开始加热铝块，温度达到55摄氏度，然后进行五分钟的孵育，让样品达到55摄氏度。

然后，机器人将保持该温度30分钟，以允许DTT减少蛋白质。在孵育过程中，准备碘乙酰胺溶液并用铝箔手动包裹，以避免暴露在光线下。孵育后，当机器人的程序暂停并显示警告消息时，确保打开样品管上的盖子，打开样品管的盖子，然后单击"恢复"继续。

接下来，手动验证机器人的程序是否已暂停并显示警告消息，在恢复协议之前，请确保碘乙酰胺已加载到位于插槽4中的两毫升管架的B6中。确认碘乙酰胺管的架子位置并打开管盖后，单击"恢复"并确保机器人将10微升碘乙酰胺溶液转移到每个样品管中，然后进行五轮混合。当机器人的程序暂停并显示消息时，关闭样品管上的盖子，盖上样品管并用箔片覆盖它们，然后用干净的箔片覆盖整个铝块，然后单击恢复继续。

等到样品在22摄氏度下孵育30分钟，并确保机器人的温度模块在碘乙酰胺孵育完成后停用。当机器人的程序暂停并显示警告消息时，确保胰蛋白酶已加载到恢复方案之前位于插槽4中的两毫升管架的C6中，将胰蛋白酶溶液放入管盖打开的两毫升管架的C6孔中，然后单击恢复继续。然后，当机器人的程序暂停并显示警告消息时，打开温度模块上样品管上的盖子，打开样品管的盖子，然后单击恢复继续。

待机时，机器人将10微升胰蛋白酶转移到每个样品管中，然后进行五轮混合。胰蛋白酶消化过夜后，使用台式微量离心机短暂旋转样品，并将样品放在磁管架上。两分钟后，用移液管将上清液小心地转移到一组新的蛋白质低结合微量离心管中，并将样品保存在冰箱中。

接下来，打开SP3_peptide_cleanup。在文本编辑器中使用 py Python 脚本，并在"仅在此处自定义"部分中根据需要指定实验变量。然后，将脚本上传到 Opentrons 应用程序中的"协议"选项卡。

将所需的实验室器具和移液器放在Python脚本中指定的OT2甲板中的相应位置，并确保磁性模块已打开电源并连接到机器人。在磁性模块的顶部放置一个新的两毫升，96孔深的孔板。接下来，将消化的样品放入从A1开始垂直向下移动的两毫升管架中。

然后，确保机器人将55微升的消化样品转移到磁性模块上的深孔板中的孔中。验证机器人协议是否已暂停并显示消息，在恢复协议之前，请确保准备好的磁珠已加载到位于插槽4中的两毫升管架的A6中。然后，在微型台式离心机中涡旋SP3珠子并短暂旋转，并将它们放置在两毫升管架的A6孔中，盖子打开。

验证机器人程序是否已暂停并显示消息，确保在恢复协议之前，已将80%乙醇加载到位于插槽5中的15毫升加50毫升管架的A4中。然后，将80%乙醇溶液放入管架中的A4孔中，然后单击"恢复"继续。观察机器人何时将移液速度变慢，从每个孔中吸出上清液，并将其分配到废液管中。

等到机器人将移液速度变回默认值并脱离磁性模块。当机器人程序暂停并显示消息时，打开碳酸氢铵管上的盖子，打开碳酸氢铵溶液的盖子，然后单击"恢复"继续。待机时，机器人脱离磁性模块，将250微升碳酸氢铵缓冲液转移到每个孔中，并立即混合10次。

然后，观察机器人将移液速度变慢，并将上清液从每个孔转移到废液管中。等到机器人将100微升碳酸氢铵缓冲液转移到每个孔中，并立即混合10次。验证机器人程序是否已暂停并显示消息，确保在恢复协议之前已将新的收集管放置在两毫升铝块中。

然后，在最初在块中的最后一个样品管之后立即将一组新的低蛋白保留微量离心管放入铝块中，然后单击"恢复"继续。待机，而机器人将碳酸氢铵缓冲液中的每个样品转移到新的两毫升管中。当机器人的程序暂停并显示消息时，确保胰蛋白酶已加载到位于插槽4中的两毫升管架的C6中，然后再恢复方案，将胰蛋白酶溶液放入管盖打开的两毫升管架的C6孔中，然后单击恢复继续。

程序运行完成后，用石蜡膜包裹样品管盖，将所有样品转移到温控混合器中，并在37摄氏度下孵育16至20小时，振动1， 000 RPM。使用BSA样品，鉴定出728个肽谱匹配的培养基和65个肽，变异系数分别为5.2%和3.2%。对于复杂的心脏样本，在10次运行中鉴定出9，526个肽谱匹配，7，558个肽和1，336个蛋白质的培养基，分别具有7.6%5.9%和3.6%的变异系数。

为了确定肽定量的变异性，计算了映射到独特蛋白质的10种肽的提取离子色谱图强度的变化系数。当将人与机器人实验结果在测量蛋白质浓度方面的变异性与BCA测定进一步比较时，机器人BCA测定的平均变异系数低于人体手动BCA测定。该协议减少了处理每个样品的台架时间。

它为我们探索多种药物治疗之间细胞系中的蛋白质组学差异铺平了道路。