Este trabajo fue financiado por el Children's Cancer Research Fund (CCRF) y nih R01 AI146009 a B.S.M.

Se obtuvieron muestras de leucoféresis de donantes sanos de un banco de sangre local. Todos los experimentos descritos aquí fueron determinados como exentos para la investigación por la Junta de Revisión Institucional (IRB) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad de Minnesota.
NOTA: Todos los experimentos se realizaron en cumplimiento de la precaución universal para patógenos transmitidos por la sangre, con técnicas estériles/asépticas y equipos adecuados de nivel 2 de bioseguridad.
1. Preparar suplementos para el medio de expansión de células B
<ol><li>Reconstituir oligonucleótido CpG a una concentración de 1 mg/ml.</li>
	<li>Reconstituir ligando CD40 (CD40L) a una concentración de 100 μg/ml.</li>
	<li>Reconstituir il-10 humano recombinante (rhIL-10) a una concentración de 50 μg/ml.</li>
	<li>Reconstituir el humano recombinante IL-15 (rhIL-15) a una concentración de 10 μg/ml. NOTA: Mantenga cada suplemento en alícuotas pequeñas a -20 °C a -80 °C durante un tiempo de hasta 6 meses.</li>
</ol>2. Preparar el medio basal
<ol><li>Combine el medio basal de células B con un suplemento de medios de 5% (v/v) para la expansión de células inmunes in vitro (por ejemplo, CTS Immune Cell SR) y 1% (v/v) penicilina y estreptomicina.</li>
	<li>Filtre-esterilizar el medio basal utilizando un adaptador de filtro de 0,22 μm en una botella esterilizada.</li>
	<li>Mantenga el medio basal a 4 °C durante un mes.</li>
</ol>3. Preparar el medio de expansión de células B
<ol><li>Transfiera la cantidad requerida del medio basal a un recipiente estéril para cultivo de las células B a 5 × 105 celdas/ml.</li>
	<li>Complementar el medio basal con 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 y 10 ng/mL rhIL-15.</li>
	<li>Filtre el medio de expansión de células B utilizando un filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Eequilibrar el medio de expansión de células B en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C, 5% CO2 con humedad durante al menos 30 minutos antes de su uso. NOTA: Prepare el medio de expansión de células B fresco para usarlo durante un día. No prepare el medio de expansión de células B para usarlo durante varios días. Esta receta de medios fomenta la proliferación de células B de memoria y células B humanas primarias activadas.</li>
</ol>4. Purificación y expansión de células B humanas
NOTA: Agregue alcohol isopropílico 99-100% a un recipiente de congelación controlado por temperatura, siguiendo las instrucciones del fabricante, y enfríe el recipiente congelado a 4 °C antes de iniciar el paso 4.1.
<ol><li>Aísle los PBMCs de una muestra de leucoforesis
	<ol>
<li>Transfiera una muestra de leucoforesis (aproximadamente 8-10 ml) a un tubo cónico estéril de 50 ml.</li>
		<li>Sube el volumen a 35 ml con solución salina estéril de 1x tamponado de fosfato (PBS).</li>
		<li>Coloque cuidadosamente una muestra de leucoforesis de 35 ml en 15 ml de medio de gradiente de densidad.</li>
		<li>Centrífuga a 500 × g durante 25 minutos sin freno, retire la capa de plasma sin perturbar la capa buffy (capa PBMC), recoja los PBMCs de la interfaz y transfiérala a un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml.</li>
		<li>Suba los PBMCs a 50 mL con 1x PBS.</li>
		<li>Centrífuga a 500 × g durante 5 minutos sin freno. Retire el sobrenadante sin perturbar el pellet PBMC, que puede parecer rojo.</li>
		<li>Añadir 7 ml de amortiguador de lisis de amonio-cloruro-potasio, pipeta 3 veces para mezclar bien e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 3 minutos.</li>
		<li>Sube el volumen a 50 mL con 1x PBS.</li>
		<li>Centrífuga a 400 × g durante 5 minutos con freno de baja resistencia. Retire el sobrenadante sin molestar al pellet. El pellet debe verse rosado o blanco. NOTA: Para continuar cultivando las células B recién aisladas, prepare el medio de expansión de células B antes de iniciar el aislamiento de células B (paso 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de células B de los PBMCs usando el kit de aislamiento negativo de células B primario humano
	<ol>
<li>Resuspend PBMCs en el búfer de aislamiento a una concentración de 5 × 107 celdas/ml. NOTA: Si el número total de PBMCs es inferior a 5 × 107 celdas, reduzca el volumen del búfer de aislamiento para mantener 5 × 107 celdas/ml. Los volúmenes mínimos y máximos de suspensión celular son de 0,25 ml y 8 ml, respectivamente.</li>
		<li>Transfiera hasta 8 ml (5 × 107 células/ml) a un tubo estéril, polipropileno, de fondo redondo con tapa.</li>
		<li>Añadir 50 μL/ml de Coctelera a los PBMCs.</li>
		<li>Añadir 50 μL/ml de cóctel de aislamiento a los PBMCs, tapar el tubo e invertir 2–3 veces para mezclar.</li>
		<li>Incubar en RT durante 5 min; en el minuto4 de incubación, las microperlas magnéticas de vórtice durante al menos 30 s.</li>
		<li>Transfiera 50 μL de microperlas magnéticas por 1 ml de PBMCs, cap el tubo e invierta 2-3 veces para mezclar.</li>
		<li>Cubra hasta 10 ml con búfer de aislamiento y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo 2–3 veces.</li>
		<li>Coloque el tubo en una estación magnética e incubar en RT durante 3 minutos.</li>
		<li>Sostenga el imán y el tubo juntos, y en un solo movimiento, invierta el imán y el tubo juntos para verter la suspensión celular en el nuevo tubo. Deseche el tubo viejo.</li>
		<li>Repita el paso 4.2.8 (reduzca el tiempo de incubación a 2 min) y vierta la suspensión de la célula B en un tubo cónico limpio.</li>
		<li>Las células B enriquecidas están listas para usarse. Si las células se utilizarán inmediatamente, continúe con la sección 4.3 (Expansión de células B humanas). Compruebe la pureza de las células B aisladas por citometría de flujo (opcional). Si las células deben congelarse antes de su uso, continúe con el paso 4.2.12.</li>
		<li>Para congelar las células B, centrífuga a 400 × g durante 5 minutos, y deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
		<li>Resuspend las células en medio de congelación a 107 células/ml, y aliquot 1 mL/criovial.</li>
		<li>Coloque el criovial en el recipiente frío de congelación y guárdelo a -80 °C durante la noche; entonces, transferir el criovial congelado a un tanque de nitrógeno líquido; mantener las células congeladas hasta 1 año. NOTA: El rendimiento esperado de las células B aisladas es del 2%-8% del total de PBMCs, con una viabilidad del 95%-99%.</li>
	</ol></li>
	<li>Expansión de células B humanas NOTA: Si utiliza células B recién aisladas, omita los pasos 4.3.1–4.3.5. Cuente las células y transfiera el número requerido de células a un tubo cónico estéril y continúe con el paso 4.3.6.<ol>
<li>Suero bovino fetal precalentado (FBS) en un baño de agua antes de descongelar las células B. Preparar 20 ml de medio de expansión de células B, transferir a un matraz T25 y preequilibrar el medio en una incubadora de cultivo tisular (a 37 °C, 5% CO2,con humedad) al menos 15 minutos antes de su uso.</li>
		<li>Descongelar células B en un baño de agua de 37 °C. Mientras espera, transfiera 2 ml de FBS precalentado a un tubo cónico estéril de 15 ml.</li>
		<li>Después de que las células B se descongelan por completo, agregue inmediatamente 1 ml de FBS pre-calentado, en cuanto a gota, en la muestra. Incuba en RT durante 1 min.</li>
		<li>Pipetear suavemente para resuspend la muestra y transferir todo el volumen, en sentido dropwise, a un tubo cónico que contiene 2 ml de FBS precalentado.</li>
		<li>Sube el volumen a 15 ml con PBS estéril de 1x, tapa e invierte el tubo suavemente 2–3 veces.</li>
		<li>Centrífuga a 400 × g durante 5 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, resuspend el pellet celular con 1 ml de medio de expansión de células B pre-equilibrado, y cuente las células. El número total de celdas debe ser de aproximadamente 107 celdas.</li>
		<li>Transfiera las células a un matraz que contenga 20 ml del medio de expansión de células B prealibrado. La concentración final de las células debe ser de aproximadamente 5 x 105 células/ml.</li>
		<li>Incubar el matraz verticalmente en una incubadora de cultivo de tejidos.</li>
		<li>Actualice el medio de expansión por completo cada 2 días transfiriendo todo el volumen de células B a un tubo cónico estéril y repita los pasos 4.3.6–4.3.9. NOTA: El matraz T25 puede contener 10-20 ml de medio; El matraz T75 puede contener hasta 20-60 ml de medio.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ingeniería primaria de células B humanas
<ol><li>Ingeniero células B a 48 ± 2 h después de la expansión / activación para obtener resultados óptimos. Prepare el medio de expansión de células B, la alícuota 1 ml del medio en una placa de cultivo de tejidos de 48 pozos y el preequilibrado en una incubadora de cultivo de tejidos al menos 15 minutos antes de su uso. NOTA: Al diseñar un gBRN CRISPR/Cas9 para un gen de interés, siga los pasos descritos a continuación. - Diseñar sgRNAs utilizando una herramienta en línea11. - Diseñar sgRNAs en un exon que sea común a todas las isoformas de la proteína. - Ordenar esgRNA modificado químicamente de empresas de renombre. - el esgRNA generalmente viene en forma liofilizada; reconstituir el sgRNA en el búfer estéril DNase/RNase-free Tris-EDTA (TE) a una concentración de 1 μg/μL.</li>
	<li>Preparar sustrato transfectante CRISPR/Cas9 mezclando 1 μL (1 μg/μL) de esgRNA modificada químicamente con 1,5 μL (1 μg/μL) de Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) de nucleasa por reacción de transfección modificada químicamente. Para el control, utilice 1 μL de tampón TE en lugar de sgRNA. NOTA: Cuando se utiliza ARN CD19 para un experimento de KO genético, consulte la Figura 2 para obtener resultados. Cuando se utiliza el esgRNA AAVS1 para un experimento de KI genético, consulte la Figura 5 para obtener resultados.<ul>
<li>Mantenga todos los componentes en hielo.</li>
	</ul></li>
	<li>Mezcle suavemente y transfiera 2,5 μL de sustrato transfectante CRISPR/Cas9 por reacción en un tubo de una tira de 0,2 ml y 8 tubos; reservado en RT.</li>
	<li>Encienda un nucleofector (electroporador) y prepare reactivos de transfección como se muestra en la Tabla 1. NOTA: Este es un buen paso para una pausa, si es necesario, poniendo todos los reactivos en el hielo. Retire todos los reactivos del hielo cuando estén listos para reanudar el experimento. Cuando se utiliza la proteína S.p. Cas9, el investigador DEBE pre-complejo CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein mediante la mezcla de 1 μg de sgRNA con 5 μg de proteína S.p. Cas9, evitando cualquier burbuja, e incubando la mezcla en RT durante al menos 20 minutos antes de su uso para obtener resultados óptimos.</li>
	<li>Cuente y transfiera 106 células B por reacción de transfección en un tubo cónico estéril.</li>
	<li>Sube el volumen a 15 ml con PBS estéril de 1x y centrífuga a 400 × g durante 5 minutos. Mientras espera, prepare el reactivo de transfección de celda primaria(Tabla 2)y reserve en RT.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Resuspend el pellet celular con 10 ml de PBS estéril 1x y centrífuga a 400 × g durante 5 min.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante por completo sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Transferir 0,5 μg de MRNA GFP modificado químicamente (como reportero de transfección) por 10 células6 B al pellet de celda (opcional).</li>
	<li>Resuspend el pellet celular con reactivo de transfección de células primarias de 20 μL por 10células 6 B; mezclar suavemente pipeteando 5-6 veces. Transfiera 20,5 μL por reacción de transfección al tubo de 0,2 ml de la tira de 8 tubos que contiene 2,5 μL del sustrato de transfección CRISPR/Cas9.</li>
	<li>Pipeta arriba y abajo una vez para mezclar y transferir todo el volumen (23 μL) a una cubeta de transfección. Tapa y toque suavemente la cubeta en el banco para asegurarse de que el líquido cubra la parte inferior de la cubeta.</li>
	<li>Utilice el protocolo de células B primaria humanas en el nucleofector para la transfección. NOTA: El nucleofector (electroporador) se puede colocar y utilizar fuera de la campana de cultivo de tejido. Tapar la cubeta para asegurar la esterilidad.</li>
	<li>Reposar las células electroporadas en la cubeta a RT durante 15 min.</li>
	<li>Transfiera 80 μL del medio de expansión de células B prealibrado de la placa de cultivo tisular a la reacción de transfección en la cubeta. Coloque la cubeta en la incubadora de cultivo de tejidos durante 30 minutos.</li>
	<li>Pipetear suavemente un par de veces para mezclar y transferir todo el volumen de la muestra desde la cubeta a un pozo apropiado de una placa de cultivo de tejido de 48 pozos que contiene 1 ml del medio de expansión de células B. La concentración final de las células debe ser de 106 células/ml.</li>
	<li>Si realiza un experimento de KI genético, transfiera el vector rAAV6 a 500.000 multiplicidad de infección al pozo adecuado que contenga células electroporadas (aproximadamente 45 min después de la electroporación). Véase el ejemplo de construcción vectorial rAAV6 en la figura 4A. NOTA: Por ejemplo: Una muestra de control se electroporará sin CRISPR/Cas9 o el vector rAAV6. Una muestra solo vectorial se electroporará sin CRISPR/Cas9 y luego se transducirá con el vector rAAV6. Una muestra KI se electroporará con CRISPR/Cas9 y luego se transducirá con el vector rAAV6. rAAV6 debe contener brazos de homología aguas arriba y abajo del sitio DSB objetivo para HDR.</li>
	<li>Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% CO2 con humedad.</li>
	<li>Cuente las celdas y registre la viabilidad en el día 1 después de la ingeniería.</li>
	<li>Actualice el medio de expansión de la célula B cada 2 días contando las células y luego transfiriendo todo el volumen de las células a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrífuga a 400 × g durante 5 min, y deseche el sobrenadante sin molestar el pellet. Resuspend las células con 100 μL de medio de expansión de células B frescos, y transferir a un pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos. Sube el volumen medio para lograr una concentración celular final a 5 × 105 células/ml. NOTA: Una placa de 48 pozos puede contener hasta 1 mL medio/pozo; una placa de 24 pozos puede contener hasta 2 ml de medio/pozo; una placa de 12 pozos puede contener hasta 4 ml de medio/pozo, y una placa de 6 pozos puede contener hasta 8 ml de medio/pozo.</li>
	<li>Permita que las células diseñadas se expandan durante al menos 5 días antes de realizar análisis posteriores, como análisis de citometría de flujo, análisis TIDE y PCR de unión.</li>
</ol>

<ol>
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Se ha presentado una patente sobre los métodos de fabricación y uso de células B editadas por el genoma con M.J.J, K.L., y B.S.M. como inventores. B.S.M es consultor y posee acciones en Immusoft Inc. Immusoft Inc. ha patrocinado la investigación en el laboratorio de B.S.M.

La ingeniería precisa del genoma en células B humanas primarias ha sido un reto hasta hace poco9,10. Anteriormente habíamos publicado protocolos utilizando CRISPR/Cas9 para diseñar células B humanas primarias9. Aquí, delineamos protocolos mejorados para el aislamiento, expansión e ingeniería de células B para permitir un KO eficiente de CD19 o para la EGFP.
Aquí demostramos que nuestro protocolo de expansión permite la rápida expansión de las células B en el cultivo para una expansión de hasta 44 veces en 7 días(Figura 1). Este protocolo mostró una tasa de expansión más rápida que las reportadas por Johnson et al.9 y Hung et al.10 Los pasos críticos para asegurar una expansión saludable y rápida de las células B primarias están reponiendo el medio con nuevos factores de activación cada dos días y asegurando que el número total de células B en el cultivo no exceda de 2 × 106 células/ml.
También encontramos que nuestro protocolo mejorado para transfectar el sistema CRISPR/Cas9 para CD19 KO dio lugar a una alta eficiencia de CD19 KO(Figura 2 y Figura 3). Al igual que un estudio anterior9,observamos una ligera reducción en la recuperación celular y viabilidad después de la electroporación a las 24 h. Esto indica que la electroporación afecta el estado celular general de las células B primarias; sin embargo, las células finalmente rebotan dentro de 48 h (datos no mostrados).
El beneficio de utilizar este protocolo de electroporador es que podemos electropolar muestras a una velocidad mucho más rápida (16 reacciones en menos de 1 min), mientras que los protocolos anteriores9,10 tardan aproximadamente 10-12 minutos para 16 reacciones. Además, este sistema de transfección elimina el arco eléctrico potencial del electroporador observado en estudios anteriores9,10. Además, este método de ingeniería se puede escalar para un mayor número de células B utilizando cubetas más grandes disponibles comercialmente (datos no mostrados).
Algunos pasos críticos para garantizar una óptima salud general de las células y eficiencias de KO: En primer lugar, asegúrese de que el medio de expansión de células B esté preparado y preajustado durante al menos 15 minutos antes de su uso. En segundo lugar, el volumen total de sustrato de transfección no debe exceder del 20% (v/v) del reactivo de nucleofección. En tercer lugar, las células deben ampliarse/activarse durante 48 ± 2 h para obtener resultados óptimos. En cuarto lugar, toque suavemente la cubeta de electroporación antes de colocarla en el electroporador para asegurarse de que la solución de reacción de transfección cubra la parte inferior de la cubeta. Quinto, asegúrese de descansar las células electroporadas en la cubeta durante sólo 15 minutos en RT; dejar las células en el reactivo de la nucleofección después de la electroporación durante demasiado tiempo puede dañar la supervivencia celular general. Sexto, asegúrese de incubar las células con medios en la cubeta durante no más de 30 minutos. Séptimo, colocar 106 células electroporadas en 1 mL durante las primeras 48 h tiende a ayudar a las células a recuperarse más rápidamente que culturándolas a menor densidad (datos no mostrados). Por último, el uso de la proteína Cas9 mRNA o Cas9 dará lugar a eficiencias de edición similares (datos no mostrados); sin embargo, utilizamos cas9 mRNA para la comodidad y el costo.
Dos preocupaciones principales al usar CRISPR/Cas9 son los efectos fuera del objetivo y las translocaciones cromosómicas. Los efectos fuera del objetivo causados por pares base no coincidentes de sgRNA a la secuencia objetivo, conducen a numerosos sitios de unión posibles en el genoma y crean múltiples KOs genes no deseados. Por lo tanto, la puntuación fuera de destino prevista debe tenerse en cuenta junto con la puntuación en el objetivo para minimizar este problema. La translocación cromosómica puede ocurrir debido a efectos fuera del objetivo o al noquear múltiples genes. Esto puede causar eventos catastróficos experimental y clínicamente. Los editores base12 alteran un solo nucleótido (dos clases: editor base de citosina y editor de base de adenina) para interrumpir el elemento de empalme, crear un codón de parada prematuro o crear una mutación puntual, lo que conduce al gen objetivo KO sin DSB (revisado extensamente en otro lugar12). Por lo tanto, el enfoque de edición de base se puede utilizar para KOs de un o varios genes para eludir las translocaciones cromosómicas.
También demostramos que CRISPR/Cas9, junto con rAAV6, se puede utilizar para mediar eficazmente ki específico del sitio y expresión de EGFP en el locus AAVS1. Observamos la expresión egfp durante al menos 12 días después de la ingeniería. También observamos dos poblaciones positivas de egfp: una expresión alta y una expresión EGFP intermedia en la muestra KI el día 12(Figura 5A),mientras que la muestra de solo vectorial mostró un porcentaje mínimo de células con expresión EGFP intermedia. Especulamos que este fenómeno de "poblaciones altas e intermedias" se debe a la integración biallelic del vector. Se puede realizar una investigación adicional utilizando el PCR13 de las células intermedias y de alta EGFP para confirmar esta hipótesis. Dos advertencias sobre el uso de AAV como vector: En primer lugar, los vectores AAV tienen una pequeña capacidad de carga, hasta 4,7 kilobases, causando problemas al golpear en un gen grande. Reducir el tamaño de los brazos de homología permitirá el alojamiento de un gen más grande, lo que a su vez reducirá la eficiencia de KI (datos no mostrados). Alternativamente, la integración simultánea o secuencial de múltiples vectores de carga genética se puede utilizar14,15. Los estudios han notificado una respuesta inmune y un aclaramiento de las células transducidas por AAV en modelos animales inmunocompetentntes16,17. Como alternativa, se puede explorar una plantilla hdr de donante no viral para eludir este problema.
En resumen, hemos demostrado procesos integrales paso a paso de aislamiento, expansión e ingeniería de células B que dieron lugar a una alta eficiencia de modificación genética. Este método de ingeniería se puede utilizar para el KO genético y para estudiar las funciones de los genes en las células B. Además, este método se puede utilizar para diseñar células B para expresar un anticuerpo recombinante para luchar contra la infección. Por último, este método se puede aplicar a las células B de ingeniería para expresar y secretar enzimas terapéuticas que se pueden utilizar como una terapia autóloga basada en células para tratar las enzimopatías.

Las células B son un subgrupo del linfanato derivado de células madre hematopoyéticas. Desempeñan un papel crítico en el sistema inmune humorístico adaptativo mediante la producción de grandes cantidades de anticuerpos en respuesta a los desafíos inmunes1. Las células B también son precursoras de las células B de la memoria y las células plasmáticas de larga duración diferenciadas terminalmente, proporcionando así inmunidad humorística duradera2. Las células plasmáticas, en particular, son únicas entre las células inmunes en su capacidad para producir grandes cantidades de un anticuerpo específico mientras sobreviven durante años o décadas3. Además, la facilidad de aislamiento de la sangre periférica hace que el linaje de células B sea un excelente candidato para nuevas terapias basadas en células4.
Anteriormente, los métodos de integración aleatoria, como los que utilizan vectores lentivirales o un transposon de la Bella Durmiente, se han utilizado para diseñar células B para la entrega de transgéneros y la expresión5,6,7,8. Sin embargo, la naturaleza no específica de estos enfoques dificulta el estudio de las funciones biológicas de un gen específico en las células B y conlleva un riesgo inherente de mutagénesis insertal y expresión y/o silenciamiento variable de transgénero en el entorno terapéutico.
El sistema CRISPR/Cas9 es una poderosa herramienta de ingeniería del genoma que permite a los investigadores editar con precisión el genoma de varias células en numerosas especies. Recientemente, dos grupos, incluido el nuestro, han desarrollado con éxito métodos para la expansión ex vivo y la ingeniería genómica dirigida de las células B humanas primarias9,10. Describiremos el proceso de purificación de las células B humanas primarias de una muestra de leucoforesis. Después de eso, describiremos nuestro protocolo actualizado para la expansión de células B y la activación de celdas B aisladas. A continuación, describiremos un proceso para noquear un cúmulo de diferenciación 19 (CD19), un receptor específico de células B y un sello distintivo de las células B, mediante la electroporación para introducir el ARNM CRISPR/Cas9 junto con el ARGN CD19 en las células B activadas.
Cas9 mRNA se traduce y se une al SgRNA CD19 para formar un complejo crispr/cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP). Posteriormente, el esgRNA en el complejo lleva a Cas9 a crear rotura de doble hebra (DSB) en la secuencia objetivo en el exón 2 del gen. Las células repararán el OSD mediante "unión final no homóloga" mediante la introducción o eliminación de nucleótidos, lo que conduce a la mutación del cambio de trama y hace que el gen sea noqueado. A continuación, mediremos la pérdida de CD19 por citometría de flujo y analizaremos la formación de indel mediante el seguimiento de los indels mediante el análisis de la descomposición (TIDE).
A continuación, describiremos el proceso de uso de CRISPR/Cas9 junto con un vector AAV6 recombinante (rAAV6, una plantilla de donante para la reparación dirigida por homología (HDR)) para mediar la inserción específica del sitio de proteína fluorescente verde mejorada(EGFP) en el gen del sitio de integración del virus asociado al adeno 1 (AAVS1). El gen AAVS1 es un locus activo sin funciones biológicas conocidas y un sitio de integración viral AAV en el genoma humano; por lo tanto, se considera un "puerto seguro" para la ingeniería del genoma. Aquí, informamos que la expansión y activación de las células B permitió hasta 44 veces la expansión en 7 días de cultivo (Figura 1). La electroporación de las células B mostró una ligera reducción de la salud celular general(Figura 2A)a las 24 h después de la transfección. El análisis de la gráfica de dispersión del marcador CD19 (Figura 2B) mostró una reducción de hasta el 83% en las celdas editadas (Figura 2C).
El análisis tide de los cromatógrafos (Figura 3A) reveló que el % de indels era similar al % de pérdida de proteína por citometría de flujo (Figura 3B). El análisis de citometría de flujo del experimento KI mostró que las células que recibieron el vector AAV(Figura 4),junto con RNP, expresaron hasta un 64% de células positivas por EGFP(Figura 5A)y más tarde mostraron una integración exitosa por reacción en cadena de la polimerasa de unión (PCR) (Figura 5B). Los recuentos de células mostraron que todas las muestras se recuperaron rápidamente dentro de los 3 días posteriores a la ingeniería(Figura 5C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

Las células B son linfocitos derivados de células madre hematopoyéticas y son un componente clave del brazo humorístico del sistema inmunitario adaptativo. Hacen candidatos atractivos para terapias basadas en células debido a su facilidad de aislamiento de la sangre periférica, su capacidad para expandirse in vitro, y su longevidad in vivo. Además, su función biológica normal — para producir grandes cantidades de anticuerpos — se puede utilizar para expresar cantidades muy grandes de una proteína terapéutica, como un anticuerpo recombinante para combatir la infección, o una enzima para el tratamiento de las enzimopatías. Aquí, proporcionamos métodos detallados para aislar las células B humanas primarias de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y activar/expandir células B aisladas in vitro. A continuación, demostramos los pasos implicados en el uso del sistema CRISPR/Cas9 para el KO específico del sitio de genes endógenos en células B. Este método permite el KO eficiente de varios genes, que se pueden utilizar para estudiar las funciones biológicas de los genes de interés. A continuación, demostramos los pasos para utilizar el sistema CRISPR/Cas9 junto con un vector viral (rAAV) recombinante, asociado a adeno, para una integración eficiente específica del sitio de un cassette de expresión de transgénero en celdas B. Juntos, este protocolo proporciona una plataforma de ingeniería paso a paso que se puede utilizar en células B humanas primarias para estudiar las funciones biológicas de los genes, así como para el desarrollo de la terapia de células B.

El protocolo actualizado de expansión y activación permitió la rápida expansión de las células B hasta 44 veces en 7 días(Figura 1; n =3 donantes). En el experimento KO, el recuento de células B utilizando tinción azul trypan mostró más del 80% de células viables con una ligera reducción en la recuperación celular tanto en el control como en las muestras de KO CD19 a 24 h después de la electroporación(Figura 2A;p ≥ 0.05, n = 3 donantes). Este resultado indica que la electroporación afectó ligeramente la salud general de las células B. Las células B se recogieron el día 5 después de la transfección para la citometría de flujo y los análisis tide. Las gráficas de dispersión representativas del control y la muestra ko mostraron celdas 14% y 95% CD19 negativos, respectivamente (Figura 2B). La cuantificación de las gráficas de flujo mostró una reducción significativa en la expresión CD19 en las muestras ko en comparación con el control (Figura 2B; p ≤ 0,0001, n = 3 donantes). Los cromatogramas de secuenciación genómica (ver secuencias de imprimación en el Cuadro 3)mostraron picos dobles en las células CD19 KO B, lo que indica inserciones/eliminaciones de nucleótidos después del OSD mediado por CRISPR/Cas9, mientras que se observaron picos únicos en el control, lo que indica que no se produjo ningún OSD en esta muestra (Figura 3A). El análisis indel de los cromatógrafos (utilizando una herramienta gratuita de análisis tide en línea) de las muestras de KO mostró un alto % de formación de indel (>90 %) en el locus CD19, que es consistente con % de pérdida de proteína CD19 detectada por citometría de flujo (Figura 3B; p ≥ 0.05, n = 3 donantes). Estos resultados indican que CRISPR/Cas9 generó eficientemente un KO CD19 en células B. Las células B del experimento KI se recogieron el día 12 después de la ingeniería para la citometría de flujo y los análisis de PCR de unión (Cuadro 4). Las gráficas de dispersión mostraron el 64% de las células positivas de EGFP en la muestra que recibió el vector rAAV6 (Figura 4) junto con RNP, mientras que no se observó ninguna célula EGFP positiva en el control; se observó una positividad mínima de EGFP en la muestra que recibió solo vector AAV (Figura 5A). Una amplificación de PCR de unión (ver secuencias de imprimación en el Cuadro 3)mostró amplificadores de 1,5 Kbps en la muestra KI (Figura 5B), mientras que no se observó ningún producto PCR en la muestra de control o solo vectorial. Los recuentos de celdas mostraron que el proceso de ingeniería afecta a la recuperación celular en la muestra KI más que el control o las muestras solo vectoriales (Figura 5B). Sin embargo, todas las muestras repuntaron rápidamente dentro de los 3 días posteriores a la ingeniería (Figura 5B). En conjunto, estos resultados indican que la integración exitosa de EGFP en el locus AAVS1 conduce a una expresión estable de EGFP al menos 12 días después de la ingeniería.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig01.jpg"> Figura 1: Expansión de células B in vitro. Las células B se sembraron a 1 × 106 células el día 0 (cero) a una densidad de 5 × 105 por ml y se expandieron 44 veces en 7 días (n=3 donantes independientes). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02a.jpg"> Figura 2A: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02b.jpg"> Figura 2B: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02blarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2C" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02c.jpg"> Figura 2C: Knockout CD19 mediado por CRISPR/Cas9 (KO) en celdas B. (A) Gráfico de barras muestra >70% recuperación celular (panel izquierdo) y >80% viabilidad (panel derecho) de las células después de la transfección se observaron tanto en el control como en las muestras de KO CD19 a las 24 horas posteriores a la electroporación. (B) Las gráficas de flujo representativas de cd19 gating de células vivas muestran 84.3% y 3.43% CD19-positivo células en la muestra de control y la muestra CD19 KO, respectivamente. (C) El gráfico de barras muestra una reducción significativa del CD19 en el grupo CD19 KO mediado por CRISPR/Cas9 (p ≤ 0,0001). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig02clarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig03a.jpg"> Figura 3A: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig03alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig03b.jpg"> Figura 3B: Pérdida de proteína CD19 frente a formación de indel. (A) Los cromatogramas representan picos de secuenciación del control y la muestra de nocaut CD19 (KO). La caja gris en los picos de control resalta la secuencia de destino de CD19 gRNA con el sitio de corte predicho indicado por una flecha. CD19 KO mostró secuenciación de "picos dobles" alrededor del sitio de corte pronosticado, lo que indica la inserción/eliminaciones de nucleótidos después de la rotura de doble cadena. (B) Gráfico de barras que muestra resultados consistentes entre % de pérdida de proteína CD19 y % de formación de indel en el locus CD19 (p ≥ 0,05). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig03blarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig04.jpg"> Figura 4: construcción vectorial RAAV6 AAVS1 MND-GFP. El casete de expresión contiene una fuerte secuencia de promotor sintético (MND), seguida inmediatamente por una secuencia de codificación de proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) y una secuencia de poli adenilación (Poly A). Los brazos de homología AAVS1 flanquean aguas arriba del promotor MND y aguas abajo de las secuencias poli A. La EGFP se expresará bajo la regulación del promotor del MND. Las longitudes de secuencia se indican por encima de cada componente de la construcción. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05a.jpg"> Figura 5A: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05b.jpg"> Figura 5B: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05blarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5C" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05c.jpg"> Figura 5C: Integración específica del sitio mediada por CRISPR/Cas9 y rAAV6 del casete de reportero EGFP en celdas B en el día 12 después de la ingeniería. (A) La gráfica de flujo representativa no muestra células B positivas de EGFP ni en el control ni en la muestra de solo vectorial frente al 64,4% de las células B positivas de EGFP de la muestra knockin (KI). (B) La reacción en cadena de la polimerasa de unión de la muestra KI muestra la banda de 1,5 Kbps predicha; no se encontró ninguna banda en la muestra de control o solo vectorial. El agua se utilizó para garantizar que no hubiera contaminación durante el proceso de PCR. (C) Gráfico de barras representa el crecimiento celular del control, el vector-solamente, y las muestras EGFP-KI durante un período de 3 días después de la ingeniería. La línea rota indica la entrada de celda de 1 ×10 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61855/61855fig05clarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>nombre</td>
			<td>secuencia de gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>AAVS1</td>
			<td>5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: secuencias de gRNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivos</td>
			<td>Volumen por reacción 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución de células primarias P3</td>
			<td>16.4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento 1</td>
			<td>3,6 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Preparación de la mezcla de reactivos de nucleofectos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>descripción</td>
			<td>secuencia</td>
			<td>propósito</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimaciones de delanteros CD19</td>
			<td>5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3'</td>
			<td>Amplificar el locus CD19 para el análisis de Indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19 Introducción inversa</td>
			<td>5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3'</td>
			<td>Amplificar el locus CD19 para el análisis de Indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación delantera pcr de cruce</td>
			<td>5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3'</td>
			<td>Cruce PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cruce PCR Imprimación inversa</td>
			<td>5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3</td>
			<td>Cruce PCR</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Imprimaciones utilizadas.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>descripción</td>
			<td>Flúor</td>
			<td>clon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19 antihumano</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinte de viabilidad</td>
			<td>eFlour 780</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: Anticuerpo de citometría de flujo y tinte de viabilidad.

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para la ingeniería genómica basada en CRISPR/Cas9 de células B humanas primarias para el knockout genético (KO) y el knock-in (KI) para estudiar las funciones biológicas de los genes en las células B y el desarrollo de la terapia de células B.

Ingeniería genómica de células B humanas primarias usando CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K vistas.  University of Minnesota. Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para la ingeniería genómica basada en CRISPR/Cas9 de células B humanas primarias para el knockout genético (KO) y el knock-in (KI) para estudiar las funciones biológicas de los genes en las células B y el desarrollo de la terapia de células B.

Video: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Investigación

Biología

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generación de humanos CD40 activado por células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Electrofisiología de células enteras de células enterocromafines murino cultivadas primario

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...