Este protocolo permite a los investigadores observar cómo C-elgans responden al agonista del receptor de acetilcolina Levamisol. La sensibilidad alterada al levamisol puede sugerir defectos en la señalización de su unión neuromuscular o función muscular. Una ventaja importante es que la natación vigorosa de C-elgans en la solución de Levamisol permite a los investigadores cuantificar la parálisis dependiente del tiempo de cientos de gusanos en solo una hora.
Contar el número de gusanos en cada pozo cada cinco minutos puede ser abrumador. El número de pozos ensayados o los puntos de tiempo se pueden ajustar si es necesario. Para comenzar, prepare los medios de crecimiento de nematodos combinando tres gramos de cloruro de sodio, 2,5 gramos de tono pep y 17 gramos de agar con un litro de agua desionizada en un matraz con una barra de agitación.
Después del autoclave, coloque el medio en una placa caliente ajustada a 70 grados centígrados y revuelva a una velocidad moderada durante una hora. Agregue un mililitro de cinco miligramos por mililitro de colesterol gota a gota para evitar la precipitación. Un mililitro de un molar de cloruro de calcio, un mililitro de un molar de sulfato de magnesio y 25 mililitros de un molar de pH 6.0 tampón de fosfato de potasio a los medios.
Transfiera dos mililitros de medios de crecimiento de nematodos a cada pocillo de una placa de 24 pocillos con una pipeta serológica estéril. Deje que las placas se sequen en la mesa de trabajo durante dos días antes de sentarse con bacterias. Elija una sola colonia op 50 en caldo B y establezca el cultivo temblando a 37 grados centígrados durante la noche.
Con una pipeta estéril, deje caer 30 microlitros de suspensión OP50 sobre el agar en el centro de cada pocillo. Deje que las placas reposen a temperatura ambiente durante al menos dos días después de sentarse para permitir que se forme un césped bacteriano. Cultivar silvestre tipo unc-63 Lev10 y unc-49 C-elgan hasta la edad adulta en placas de seis centímetros, preparando al menos ocho placas por cepa.
Prepare la solución blanqueadora debajo del capó el día de la sincronización. Mezcle 10 mililitros de lejía, 2.5 mililitros de hidróxido de sodio y 37.5 mililitros de agua desionizada en un tubo de crónica de 50 mililitros. Usando una pipeta de transferencia de plástico, lave los gusanos adultos grávidos de al menos cuatro placas con tampón M9 y transfiéralos a un tubo de crónica de 15 mililitros.
Gire esos 716 g durante un minuto a temperatura ambiente y luego retire el súper nadante con una pipeta de transferencia. Agregue 10 mililitros de la solución blanqueadora. Agite suavemente el tubo durante cuatro minutos hasta que la mayoría, pero no todos los cadáveres de gusanos se hayan disuelto.
Girar a 716 G durante un minuto. Vierta la solución de lejía en un solo movimiento. Mientras el tubo no se agite en este punto, los huevos se pegarán al costado del tubo a 15 mililitros de tampón M9 e invertirán.
Girar a 716 G durante un minuto y verter el búfer M9 con un movimiento suave. Repita este lavado con solución tampón tres veces. Después del lavado final, agregue 10 mililitros de M9 fresco y colóquelo en un rotador durante la noche a 15 grados centígrados para aislar una población sincronizada de animales hambrientos en la primera etapa larvaria.
Imprima en una placa de 24 pocillos y asigne cepas a lugares aleatorios. Aproximadamente 24 horas después de la preparación de lejía, gire hacia abajo los gusanos L1 hambrientos a 716 G durante un minuto a temperatura ambiente. Retire aproximadamente nueve mililitros de tampón M9 con una pipeta de transferencia de plástico, y luego mezcle suavemente los gusanos hambrientos de la primera etapa larvaria en el tampón M9 restante.
Inmediatamente pipete tres microlitros de los gusanos y el tampón M9 en un portaobjetos de microscopio y determine el número de L1. El número deseado es de 20 a 30 L1 en tres microlitros. Pipetea tres microlitros de L1 en cada pocillo de acuerdo con el mapa de placas prefabricado, deja que los gusanos crezcan hasta la edad adulta durante tres días a 20 grados centígrados.
Imprima la hoja de datos en blanco que se utilizará para registrar el número de gusanos que se mueven en cada pocillo cada cinco minutos durante una hora. Revise los gusanos en las placas de 24 pocillos. Usando un marcador, haga una X en la tapa de la placa sobre cualquier pozo que tenga contaminación, haya muerto de hambre o tenga demasiados gusanos, lo que dificultará el conteo.
Haga una solución de levamisol de 0,4 milimolares agregando 200 microlitros de caldo de levamisol de 100 milimoles a 50 mililitros de M9. Inicie un temporizador y luego, con una pipeta de transferencia, agregue un mililitro de 0,4 milimolar de levamisol a los dos primeros pocillos, de modo que los animales naden libremente. Continúe agregando Levamisol a los pozos adyacentes, escalonando el tiempo de acuerdo con el número de pozos a ensayar. A los cinco minutos, comience a contar manualmente solo el número de gusanos en movimiento en cada pozo, comenzando con el primer pozo, y registre ese número en la hoja de datos.
Continúe contando el número de gusanos en movimiento en cada pocillo cada cinco minutos durante una hora. Al final del ensayo o cuando el tiempo lo permita, registre el número total de gusanos en cada pocillo. Obtenga la placa, mapee y registre qué cepa corresponde a cada pocillo.
Ingrese los datos en una hoja de cálculo comenzando con el número total de gusanos en cada pocillo y organizando por genotipo. Combinando los datos de los pozos, determine el número de gusanos que se mueven en cada punto de tiempo. Use esto para calcular el número que se paraliza en cada punto de tiempo.
Haga una tabla de datos tal que la columna de la izquierda indique el tiempo y las columnas siguientes contengan los datos de cada cepa. Para cada animal que esté paralizado dentro de los primeros cinco minutos, cree una fila e ingrese una durante cinco minutos. Repita esto para cada punto de tiempo.
Para todos los animales que no se paralizan al final del ensayo, introduzca un cero durante 60 minutos. Utilice estos datos para crear una curva de supervivencia en el software estadístico específico utilizado aquí para mostrar visualmente la parálisis dependiente del tiempo de la población. Los datos de todas las cepas ensayadas deben introducirse en la misma tabla de datos, dejando los espacios necesarios.
Las mutaciones en las subunidades del receptor de acetilcolina de Levamisol, así como en los genes necesarios para la agrupación de receptores de acetilcolina sensibles a Levamisol postsinápticos, causan resistencia a la parálisis inducida por Levamisol como se observa en los mutantes unc-63 y Lev-10 respectivamente. La pérdida del canal iónico activado por GABA unc-49 causó hipersensibilidad al levamisol debido a la interrupción del equilibrio adecuado de la señalización colinérgica y GABAérgica. La preparación adecuada de 24 placas de pocillos es esencial.
Si el césped bacteriano no está seco antes de detectar L1, la solución de Levamisol puede volverse turbia durante el ensayo, lo que inhibe la observación. Mediante la modificación de las placas de 24 pocillos, este protocolo se puede realizar con animales derribados con ARNi. Esto permite a los investigadores estudiar los genes de C-elgan, para los cuales los mutantes no están disponibles.
