Este protocolo es el sistema autólogo para el cultivo de fibroblastos humanos con plasma rico en plaquetas propio del paciente y una preparación estandarizada durante cinco minutos. El PRP promueve una expansión celular masiva de fibroblastos en cultivo. Le recomendaría que utilice este método utilizando PRP como un suplemento celular cuando necesite una expansión celular masiva y segura para terapias celulares autólogas.
Cuando intente este protocolo, le recomendaría que verifique la integridad del PRP. Su plasma tiene que estar muy limpio con ausencia de glóbulos rojos. Cuando lo transfieres, tienes que hacerlo con mucho cuidado.
Y con respecto a la digestión de su tejido, tiene que estar muy limpio antes de continuar. Para comenzar, gire cuidadosamente los tubos de plasma rico en plaquetas llenos de sangre, o PRP, al revés tres veces para mezclar la sangre con anticoagulante. Centrifugar las muestras de sangre a 1500 g durante cinco minutos en un rotor fijo en ángulo de 45 grados y equilibrar los tubos.
Después de la centrifugación, la sangre fraccionada tiene glóbulos rojos y blancos atrapados debajo del gel separador y las plaquetas en la superficie del gel. Invierta suavemente el tubo de PRP 20 veces para resuspender el depósito de plaquetas en el sobrenadante plasmático. Asegúrese de que las plaquetas estén completamente separadas del gel y que el plasma cambie de claro y transparente a turbio.
Recoja la solución plasmática del tubo utilizando un dispositivo de transferencia conectado a una jeringa de 10 mililitros. Coloque las muestras de piel en un tubo de polipropileno de 50 mililitros con PBS y agite el tubo suavemente. Si la muestra de piel es relativamente grande, colóquela en la tapa de un plato de cultivo de tejido de 150 centímetros cuadrados con el lado epidérmico hacia abajo.
Retire el tejido graso subcutáneo con un par de fórceps y tijeras. Para evitar que el tejido se seque, enjuague el tejido cada pocos minutos en PBS. Cuando se complete la eliminación de grasa, use un bisturí para cortar las muestras de piel en tiras, aproximadamente 0.5 por 1.5 centímetros.
A continuación, agregue cinco mililitros de mezcla de colagenasa / dispasa a un tubo estéril de 15 mililitros. Transfiera el tejido cortado al tubo. Asegúrese de que las piezas de tejido estén sumergidas en la solución y tape el tubo de forma segura.
Coloque los tubos en una incubadora a 37 grados centígrados con agitación orbital durante 150 minutos. Después de la incubación, mueva el tubo que contiene el tejido al gabinete de bioseguridad. Coloque la tapa de un plato de cultivo estéril de 100 milímetros boca abajo en el gabinete de bioseguridad.
Transfiera la suspensión de tejido al fondo de la placa de cultivo de 100 milímetros sin salpicaduras. Si quedan pedazos de tejido en el tubo, use una pipeta estéril de un mililitro o pinzas estériles para transferir las piezas al fondo de la placa de cultivo. Con la epidermis hacia arriba, sostenga la dermis con un par de fórceps.
Agarre el borde de la epidermis con otro par de fórceps y separe la dermis y la epidermis. Manteniendo las piezas separadas en la misma tapa, coloque las piezas dérmicas en un nuevo plato de cultivo de 100 milímetros que contenga PBS. A continuación, utilizando pinzas de laboratorio, transfiera las piezas dérmicas a un tubo de polipropileno de 15 mililitros que contenga tres mililitros de Tripsina PBS al 0,3%.
Incubar el tubo en un baño de agua de 37 grados centígrados y mezclar el contenido cada dos o tres minutos invirtiendo el tubo varias veces. Después de 10 a 20 minutos, detenga la reacción agregando de tres a cinco mililitros de medio de crecimiento completo helado. Vortex el tubo vigorosamente varias veces.
Filtre la suspensión, que contiene los fibroblastos, a través de una malla de nylon de 85 micras en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar la solución de fibroblastos a 150 g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 100 a 200 microlitros de medio de crecimiento completo para el recuento celular.
Colocar las células en un matraz de cultivo de tejidos de 25 centímetros cuadrados. A continuación, incubar el matraz a 37 grados centígrados. Cambie el medio que contiene células no adherentes al día siguiente, y nuevamente, cada tres o cuatro días.
Cuando los fibroblastos alcancen 70 a 80% de confluencia, lávelos con PBS y agregue solución de tripsina-EDTA. Después de incubar el matraz durante tres minutos a 37 grados centígrados, detenga la reacción agregando de tres a cinco mililitros de medio de crecimiento completo caliente. Luego, centrifugar la suspensión celular a 200 g durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante por aspiración. Cultivar los fibroblastos en medio PRP e incubar a 37 grados centígrados. La densidad celular mínima recomendada es de 4.000 células viables por centímetro cuadrado.
Se utilizó un dispositivo médico dedicado para producir PRP procesando sangre total de 10 pacientes diferentes. El dispositivo eliminó la mayoría de los glóbulos rojos y glóbulos blancos. La concentración media de plaquetas en el PRP fue aproximadamente un 50% más alta que la concentración de plaquetas en sangre total.
Los fibroblastos autólogos se cultivaron en medio con 10% de FBS o en medios con concentraciones de PRP que variaron de uno a 50%Después de siete días de cultivo, sin cambiar el medio, los cultivos cebados con 20% de PRP exhibieron un mayor número de fibroblastos viables. El PRP tuvo efectos potentes como un refuerzo de la proliferación hasta 7.7 veces en comparación con FBS. La tinción con faloidina mostró que el cambio morfológico observado tras la activación del PRP estaba relacionado con la reorganización de la actina F, que es una firma de la activación de fibroblastos.
Una preocupación importante de la rápida expansión celular es el riesgo de modificación genómica. Para evaluar esto, puede realizar un ensayo de hibridación genómica comparativa para evaluar la estabilidad genómica de sus células. La principal ventaja de esta técnica es reemplazar FBS por un PRP, que es un suplemento biológico autólogo más potente.
Con esto, el investigador puede crecer más células más rápido sin ninguna adición de sustancias xenogénicas. Podemos utilizar esta técnica para otros tipos de células que necesitan expansión ex vivo antes de la aplicación clínica, por ejemplo, queratinocitos o células madre mesenquimales.
