El protocolo de transfección basado en NanoDispenser desarrollado para describir en este video representa el primer método de transfección fácil de usar y de alto rendimiento que permite que incluso los principiantes en el campo tengan éxito. Esto es fácil en la técnica de alto rendimiento permite la transfección de la célula con 384 condición independiente. A partir de ahora, el método es de bajo costo debido al nano volumen de reactivo necesario.
Para definir los mejores parámetros de transfección para todo el tipo de célula, sugerimos mantener constante la concentración de ADN de origen y utilizar cantidades variables de ADN trans infectado, reactivo de transfección y número de células. Para dispensar la suspensión de 40 celdas de microlitro, monte un casete de 10 microlitrotros en el dispositivo de manipulación de líquido peristáltico y prepare un programa adecuado. En primer lugar, ajuste el parámetro de caudal a bajo para dispensar células con una velocidad baja para evitar promover el daño potencial a las células por estrés total y alto impacto en la parte inferior de los pozos.
A continuación, ajuste la altura de dispensación a 11,43 milímetros. La altura debe ser lo suficientemente alta como para reducir el impacto celular en la parte inferior de los pozos durante el proceso de dosificación, pero lo suficientemente baja como para evitar la retención de las gotas en el cabezal dispensador. A continuación, ajuste la altura clara de la placa a 16 milímetros para permitir el desplazamiento libre del cabezal dispensador sobre la placa después de dispensar cada fila.
Controle visualmente los ajustes adecuados de la altura del cabezal del manipulador de líquido peristáltico. Asegúrese de que no se retienen gotas en las puntas de dosificación durante la dispensación. Compruebe también que el cabezal es lo suficientemente alto como para permitir el desplazamiento de la cabeza después de dispensar cada fila.
Para generar listas de selección para impulsar la ade-dispensación, se desarrolló una macro de hoja de cálculo fácil de usar para gestionar las cantidades de ADN y mezclar hasta cuatro plásmidos en un formato de placa de 384 pozos. Los volúmenes óptimos se rellenan previamente en algunas celdas de la hoja de cálculo, pero se pueden cambiar. En los campos rosados, el reactivo de transfección, o valor de mezcla TR, se establece en 500 nanolitros.
El valor de volumen mínimo en los pozos de placa de origen se establece en cuatro microlitros, y el volumen máximo en los pozos de placa de origen a 11,25 microlitros. Introduzca 100 nanogramos por MICROlitro DE ADN iniciando concentraciones en los campos azules correspondientes al ADN subyacente. A continuación, introduzca la cantidad de ADN deseada en los campos gris y verde correspondientes a los 384 pozos de la placa.
Introduzca las cantidades y los nombres de plásmido y asegúrese de que se utiliza la misma ortografía si el mismo plásmido tiene que ser trans infectado en varios pozos. Haga clic en generar listas de selección para verificar los valores introducidos y, si se solicita, corrija las celdas rellenas de naranja indicando errores o volúmenes que NanoDispenser no puede controlar. Si no se detecta ninguno, la macro generará la guía de dispensación de pozos 384, el archivo de lista de selección de ADN y el archivo de lista desplegable TR a partir de los datos recopilados en las hojas correspondientes.
Imprima la plantilla desde la hoja de placa de origen para visualizar los pozos que se deben rellenar antes de dispensar. Se indican los nombres de plásmido y los volúmenes de relleno mínimos. Los volúmenes de mezcla de reactivos de transfección que se rellenarán en los siguientes pomos, se indican como TR y se resaltan en verde.
Para preparar la placa de origen de ADN, diluya el plásmido de ADN almacenado a 100 nanogramos por microlitro utilizando agua destilada. Ahora, calibre la rejilla del pozo 384 a las dimensiones de la placa. Abra la aplicación 384 Well Pipetting Guide en una tableta.
Coloque el lugar de origen en la cuadrícula de la pantalla inferior. En el menú de calibración superior izquierdo, haga clic en más o menos para mejorar o reducir el tamaño de la cuadrícula y los pozos con el fin de ajustar los pozos verdes a los cuatro pozos de esquina de la placa. Con cinta adhesiva de doble cara, monte el adaptador de placa impresa 3D en la pantalla para evitar movimientos de la placa de origen durante la dosificación.
Si es necesario, mueva la rejilla calibrada con las flechas de rotación y los botones hacia arriba, abajo, derecha y izquierdo para ajustar la cuadrícula a la posición de la placa. Una vez que la rejilla y los tamaños de los pozos estén correctamente calibrados y localizados, marque la caja de calibración de bloqueo. Haga clic en el archivo y abra la guía 384-Wells-Pipetting.
csv. Siga las instrucciones de la pantalla para dispensar manualmente el volumen indicado de plásmido en la concentración especificada en el pozo resaltado en blanco que corresponda al destino objetivo adecuado de la placa esperada. Utilice flechas menos o más para retroceder o más en el proceso de dosificación de ADN.
Deje de dispensar al llegar a la primera solución de reactivo de transfección para cargar. Una vez finalizadas las dispensaciones de ADN, retire la placa de origen del adaptador. Si se van a llenar varias placas de origen, coloque una nueva placa de origen en el adaptador y siga las instrucciones de dosificación.
Centrifugar las placas de origen llenas de ADN para asegurar una nivelación adecuada del líquido y para eliminar las burbujas que conducen a la imprecisión en las transferencias de base ade. Ahora, ejecute una encuesta para controlar los volúmenes dispensados manualmente. En el PC NanoDispenser, ejecute el programa NanoDispenser.
Vaya a la pestaña de diagnóstico, marque la bandeja de salida de la placa de origen, cargue la placa de origen en el soporte de la placa y marque para entrar en la placa. Cuando se le solicite, seleccione 384LDV_AQ_B2 para establecer nanoDispenser en el modo de dosificación de búfer acuoso y pulse OK. Seleccione la encuesta en el menú varios. Y haga clic en el lanzamiento.
Seleccione los pozos precargados para analizar y haga clic en el botón ir. Compruebe que los volúmenes medidos coincidan con los esperados y asegúrese de que no se han cargado pozos con volúmenes de más de 12 microlitros. Preparar el tubo con medio libre de suero llenando un nuevo recipiente estéril con 10 mililitros de medio libre de suero precalentado y sumergiendo el organizador del tubo en él.
Pulse el botón primo del manipulador de líquido peristáltico durante unos 10 segundos. Asegúrese de que la punta no esté obstruida inspeccionando visualmente el flujo del cabezal dispensador. Coloque una placa de cultivo estéril de 384 pozos en el soporte de placa de manipulador de líquido peristáltico y retire su tapa.
Ejecute el programa precalibrado para dispensar un microlitro en cada pozo de la placa de 384 pozos. El tiempo de dosificación es de aproximadamente ocho segundos. A continuación, reemplace la tapa de la placa de pozo 384.
Para configurar la dispensación de ADN impulsada por ADE, ejecute el software de lista de selección. Establezca los pozos 384 en 384LDV. Ajuste el dispositivo al modo de dispensación de búfer acuoso seleccionando 384LDV_AQ_B2.
Y los tipos de placa de destino para Greiner_384PS_781096. Un-tick optimizado el rendimiento de la transferencia. Seleccione la pestaña Lista de selección.
Haga clic en importar. Y seleccione el archivo DNA_Picklist_CSV. A continuación, haga clic en reproducir y guarde el protocolo.
Haga clic en simular para realizar una simulación de las dispensaciones del programa para asegurarse de que la lista de selección coincide con el diseño experimental esperado. Haga clic en el botón de ejecución e inicie el programa de dispensación. Cuando se le pregunte, inserte la placa de origen solicitada.
Y luego la placa de destino en el NanoDispenser. Para configurar la dispensación del reactivo de transfección, trabaje en un gabinete de bioseguridad para diluir el reactivo de transfección lipopolíplex en un medio libre de suero a una concentración final de una x y vórtice el tubo. Dispensar inmediatamente la mezcla TR de acuerdo con la placa de origen predefinida digna de la macro y utilizando la aplicación de guía de pipeteo de 384 pozos precalibrada.
Después de la dosificación de TR, realice una encuesta para controlar los volúmenes cargados TR como se hizo antes para el ADN cargado. Seleccione la mezcla de reacción de transfección de pozos precaridos para analizar. Y haga clic en el botón ir.
Compruebe que los volúmenes medidos coincidan con los esperados. Y asegúrese de que no se han cargado pozos con volúmenes de más de 12 microlitros. Ahora realice un restablecimiento de la lista de selección de ADN en el software de la lista de selección.
Verifique que los parámetros del dispositivo todavía estén fijados a los buffers acuosos. Introduzca los tipos de placa de origen y de destino correctos. En la pestaña lista de selección, haga clic en Restablecer para borrar la lista de muestra.
A continuación, haga clic en importar y elija el TR_Picklist. CSV. Haga clic en jugar.
Guarde el protocolo si se le solicita y realice una simulación de las dispensaciones de mezcla de reactivos de transfección del programa para garantizar un diseño adecuado haciendo clic en el botón simular. Como se hizo anteriormente, después de hacer clic en el botón de ejecución e iniciar el programa de dosificación coloque la placa de origen y luego la placa de destino en el NanoDipsenser según lo solicitado. Para dispensar las células, llene un nuevo recipiente estéril con la suspensión celular preparada y revuelva para evitar la sedimentación que conduce a la imprecisión y la densidad celular.
Inserte el organizador del tubo en la solución. Luego, presione el botón primo hasta que la suspensión de la célula comience a enjuagar desde el cabezal dispensador. Asegúrese de que la punta no esté obstruida inspeccionando visualmente el flujo del cabezal dispensador mientras se vacía y asegúrese de que cada tubo esté cargado con suspensión celular.
Ahora, cargue el ADN y la placa de destino de 384 pozos llenos de TR en el portador de placa de manipulador de líquido peristáltico y retire su tapa. Ejecute el programa precalibrado para dispensar 40 microlitros de la suspensión celular en la placa completa de 384 pozos. El tiempo de dosificación es de unos 45 segundos.
Por último, reemplace la tapa de la placa de 384 pozos. La transfección de las células de HeLa usando reactivo lipopolyplex fue exitosa. Las cantidades de ADN que oscilaban entre cinco y 30 nanogramos mostraron la misma eficiencia y hasta un 90% de transfección de células a un volumen diluyente de microlitro.
Por el contrario, cantidades más altas resultaron en una disminución abrupta en el porcentaje de células trans infectadas. Se probaron varios volúmenes diluyentes que van desde 15 nanolitros hasta cuatro microlitros y se identificó un microlitro como la mejor condición. Para mejorar aún más el rendimiento de este protocolo se probaron dos métodos eficientes de almacenamiento de ADN, a saber, el almacenamiento en seco de la placa o el almacenamiento congelado.
Ambos métodos de almacenamiento no dieron lugar a resultados significativamente diferentes a la solución de ADN recién dispensada almacenada durante un máximo de siete días. Como la transfección plasmática suele emplear al menos dos plásmidos diferentes, la capacidad de multiplexación de ADN de este protocolo se examinó utilizando las condiciones mejor identificadas. La proteína fluorescente roja tdTomato utilizada anteriormente que expresa el plásmido fue modificada para expresar mVenus una proteína fluorescente de color amarillo brillante y ambas fueron utilizadas en intentos de cotransfección.
El análisis de células positivas fluorescentes rojas o verdes mostró que la eficiencia de la transfección era de alrededor del 80%Sin embargo, casi el 100% de los glóbulos rojos también fueron cotrans infectados con el mVenus expresando plásmido como se puede ver en el análisis de imagen basado en software representativo. Una vez que los DNAs han sido dispensados en la placa de origen. Realice una encuesta para asegurarse de que los volúmenes esperados se han cargado y no superan los 12 microlitros.
Durante la dosificación del reactivo de transfección en la placa de origen, trate de evitar burbujas, ya que las subplagas centrifugadoras darán lugar a una pérdida completa de la eficacia de la transfección. Este método se puede aplicar a experimentos biológicos, crímenes y transfección y es adecuado para la mayoría de los que se pueden realizar en un formato de placa de 384 pozos. Una transfección a prueba de fuego allana el camino para nuevas aplicaciones, como el plásmido basado en plásmido conocido por enfoques de no cribado de fundición más nítidos, lo que permite la supervisión del efecto intermitente que actualmente no puede clasificarse en estrategias deficientes.
