Este protocolo proporciona un medio para el cultivo de células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes. Es fácil desarrollar las vesículas gigantes, y sólo se requiere un volumen muy pequeño de solución de muestra para preparar las vesículas. Demostrando el procedimiento estará Yuri Ota, un candidato al doctorado de nuestro laboratorio.
Comience añadiendo 20 microlitros de solución POPC recién preparada y cuatro microlitros de biotina-PEG-DSPE recién preparada a un vial de vidrio. Evaporar el disolvente orgánico por flujo de aire hasta que se forme una película lipídica. Coloque la película en un desecador durante una hora para evaporar completamente el disolvente orgánico.
A continuación, añada 200 microlitros de aceite mineral al vial. Cubra la abertura del vial con película de parafina de plástico y sonice el contenido del vial en un baño ultrasónico a 120 vatios durante al menos una hora. Para una pequeña preparación de vesícula, cree una película de lípidos, como acaba de demostrar, y agregue 200 microlitros de glucosa de 200 milímetros en el medio LB a la película.
Luego sonicar la película a 120 vatios durante al menos una hora, seguido de la extrusión de las vesículas gigantes resultantes en pequeñas vesículas utilizando un mini extrusor y una membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 100 nanómetros. Para el preculcalo celular bacteriano, inocular E.coli de una placa LB a mililitros de medio LB para un cultivo nocturno a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, transfiera 20 microlitros del sobrenadante de la cultura a 1,98 mililitros de medio LB fresco para dos horas adicionales de cultivo.
Al final de la incubación, compruebe la densidad óptica a 600 nanómetros, o valor OD 600, de la solución de pre-cultivo en un espectrofotómetro. Se debe utilizar una solución de precaldescalado con un OD 600 de uno a 1,5. A continuación, mezcle la solución de precultiva con la solución de sacarosa recién preparada y el medio LB fresco, según la tabla uno.
Para la formación de vesículas gigantes, agregue 50 microlitros de una solución acuosa externa recién preparada de vesículas gigantes a un tubo de plástico con tapa de 1,5 mililitros. Capa suave 150 microlitros de la solución de aceite que contiene lípidos sobre la solución acuosa externa de vesículas gigantes. Incubar la solución resultante durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, antes de comprobar que la interfaz del aceite y las soluciones acuosas es plana.
Para la formación de gotas de agua y aceite que contengan gotas, agregue dos microlitros de una solución acuosa interna recién preparada de vesículas gigantes a 50 microlitros de la solución de aceite sonicado que contiene lípidos en un tubo de plástico con tapa de 0,6 mililitros. A continuación, toque el tubo para emulsionar los dos componentes. A continuación, utilice una pipeta para añadir 50 microlitros de agua y solución de gotas de aceite a la interfaz del aceite y la solución acuosa, y sedimentar las vesículas gigantes que contienen células bacterianas por centrifugación.
A continuación, aspirar la capa de aceite superior y recoger las vesículas gigantes. Para preparar una cámara hecha a mano, taladre un agujero de siete milímetros con un punzón hueco en un sello de 10 por 10 por un milímetro de doble cara, luego pegue el sello de doble cara en un vidrio de cubierta de 30 por 40 milímetros. Para preparar una membrana de dos capas soportada, agregue 30 microlitros de la pequeña solución de vesícula al orificio de la cámara hecha a mano.
Incubar las vesículas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de la incubación, lave suavemente el agujero dos veces con 20 microlitros de medio LB, complementados con 200 milmiles de glucosa. Para inmovilizar las vesículas gigantes en la membrana bicapa de la partida, introduzca 10 microlitros de neutravidina en la solución de vesícula gigante acuosa externa al agujero para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave suavemente el agujero dos veces con 20 microlitros de medio LB, complementados con glucosa de 200 milmilinos, y agregue todo el volumen de solución de vesícula gigante al agujero en la cámara. A continuación, selle el orificio con un vidrio de cubierta de 18 por 18 milímetros. Para monitorear el crecimiento bacteriano dentro de las vesículas gigantes, seleccione el objetivo 40X en un microscopio invertido y coloque la cámara en el sistema de calentamiento del microscopio.
Luego incubar las vesículas gigantes que contienen células bacterianas en la cámara en condiciones estáticas durante seis horas a 37 grados Celsius, capturando y registrando imágenes del crecimiento de células bacterianas cada 30 minutos, con la cámara semiconductora de óxido metálico complementaria científica. Las vesículas gigantes que contienen células bacterianas suelen variar en tamaño de 10 a 30 micrómetros. Para ambos tamaños de vesículas gigantes, las células de E.coli se someten a procesos de alargamiento y división, con algunas células de E.coli creciendo a un gran número de células durante el período de observación de seis horas.
La frecuencia relativa de las vesículas gigantes que contienen un nivel de célula única es aproximadamente el 10% de las vesículas gigantes obtenidas, y las vesículas gigantes encapsuladas a nivel de célula única son aproximadamente el 50% de las vesículas gigantes que contienen células bacterianas. La estabilidad de la interfaz aceite-agua es importante para obtener vesículas gigantes que contienen células bacterianas. Tenga cuidado de aspirar el aceite cuidadosamente antes de la corrección de la vesícula gigante.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes individuales. Nuestro método de cultivo bacteriano es una nueva herramienta en microbiología para el cultivo de bacterias ambientales desconocidas para obtener o analizar sus productos metabólicos.
