巨型囊泡内单细胞层的细菌细胞培养

该协议为在巨型囊泡内的单细胞水平上培养细菌细胞提供了一种手段。开发巨型囊泡很容易，只需非常小的样品溶液来制备囊泡。演示该程序将是尤里大田，一个博士候选人从我们的实验室。

首先，在玻璃瓶中加入20微升新鲜准备的 POPC 溶液和 4 微升新鲜准备的生物素 PEG-DSPE 溶液。通过气流蒸发有机溶剂，直到形成脂质膜。将薄膜放在干燥器中一小时，以完全蒸发有机溶剂。

然后在小瓶中加入200微升矿物油。用塑料石蜡膜盖住小瓶的开口，在120瓦的超声波浴中对小瓶内的内容物进行声波化，至少一小时。对于小囊泡制备，创建脂质膜，正如刚刚演示的，并在 LB 介质中加入 200 微升 200 毫米葡萄糖。

然后用120瓦对薄膜进行声波化至少一小时，然后用迷你挤出机和100纳米孔径的聚碳酸酯膜将产生的巨型囊泡挤出到小囊泡中。对于细菌细胞预培养，将大肠杆菌从LB板接种到LB培养基的毫升中，在37摄氏度下进行过夜培养。第二天早上，将20微升的培养物的上一代转移到1.98毫升的新鲜LB培养基上，再进行两个小时的培养。

在孵化结束时，检查分光光度计上培养前溶液的光学密度为 600 纳米（OD 600 值）。应使用 OD 600 的 1 到 1.5 的培养前解决方案。然后根据表一将培养前溶液与新鲜准备的蔗糖溶液和新鲜的 LB 介质混合。

对于巨型囊泡的形成，在1.5毫升盖塑料管中加入50微升新鲜准备好的巨型囊泡外水溶液。在巨型囊泡的外水溶液上轻轻层150微升含脂油溶液。在室温下孵育所得溶液 10 至 15 分钟，然后检查以确保油和水溶液的界面是平的。

对于含有液滴形成的水和油细菌细胞，在0.6毫升盖盖塑料管中，将新鲜准备的巨型囊泡内水溶液的两微升添加到含有脂质的声波含脂油溶液的50微升中。然后，点按管子对两个组件进行乳化。接下来，使用移液器将50微升水和油滴溶液加入油和水溶液的界面，通过离心沉淀含有细菌细胞的巨型囊泡。

然后吸气顶部油层，并收集巨大的囊泡。要准备一个手工制作的腔室，在 10 比 10 的双面密封上钻一个 7 毫米的孔，然后将双面密封粘贴到 30 到 40 毫米盖玻璃上。要准备一个支持的双层膜，在手工腔室的孔中加入30微升的小囊泡溶液。

在室温下孵育囊泡30分钟。在孵育结束时，用20微升LB介质轻轻洗孔两次，辅以200毫米勒葡萄糖。为了固定支架双层膜上的巨型囊泡，在外水巨型囊泡溶液中引入10微升的中性铁丹溶液，在室温下孵育15分钟。

在孵育结束时，用20微升的LB介质轻轻洗孔两次，辅以200毫米勒葡萄糖，并将整个体积的巨型囊泡溶液加入到腔室的孔中。然后用 18 由 18 毫米盖玻璃密封孔。要监测巨型囊泡内的细菌生长，请在倒置显微镜上选择 40 倍的镜面，然后将腔室放在显微镜加热阶段系统上。

然后在37摄氏度的静电条件下孵育室内含有细菌细胞的巨型囊泡6小时，每30分钟拍摄一次细菌细胞生长的图像，并记录一次，使用科学互补的金属氧化物半导体摄像机。含有细菌细胞的巨型囊泡通常大小在10至30微米之间。对于两种大小的大囊泡，大肠杆菌细胞都经历了伸长和分裂过程，一些大肠杆菌细胞在6小时的观察期内长到大量的细胞。

包含单个细胞水平的巨型囊泡的相对频率约为获得的巨型囊泡的10%，封装在单个细胞水平的巨型囊泡的大约50%是含有细菌细胞的巨型囊泡。油水界面的稳定性对于获得含有细菌细胞的巨型囊泡非常重要。在巨大的囊泡矫正前，小心吸油。

看完这段视频后，你应该对如何在单个巨型囊泡中的单个细胞水平上培养细菌细胞有一个很好的理解。我们的细菌培养方法是微生物学中培养未知环境细菌获取或分析其代谢产物的新工具。