Este protocolo utiliza un método simple para mejorar la fiabilidad de un modelo de cultivo celular 3D sin el uso de ningún equipo especial. La principal ventaja de esta técnica es que podemos llevar a cabo el experimento de cultivo 3D repetible controlando la condición de cultivo inicial dentro del dispositivo cúbico. Después de preparar un marco cúbico de policarbonato de cinco por cinco milímetros, coloque el marco en una diapositiva preenfriada y una caja de hielo y utilice una pipeta para agregar 12 microlitros de 1.5% de aguantó previamente desde la cara superior del marco cúbico a la superficie inferior.
Esparce la agarosa para obtener una superficie plana y permitir que el polímero se cure. Utilice pinzas para deslizar el marco hasta el borde del cristal y gire el marco de modo que el lado abierto esté mirando hacia abajo antes de volver a colocar el marco en la diapositiva. Después de llenar las siguientes dos superficies del marco con más agarosa, como se acaba de demostrar, deje caer la agarosa en un recipiente de una cara abierta para formar una pared de agarosa en los lados cuarto y quinto.
Para configurar una forma de clúster de celdas inicial, inyecte una matriz extracelular adecuada para el cultivo celular de interés en el espacio de cultivo de cubo de gel híbrido y establezca un micromolde fabricado en el cubo. A continuación, coloque el cubo en una incubadora de dióxido de carbono durante 25 minutos a 37 grados centígrados. Cuando se cure la matriz extracelular, levante cuidadosamente el micromolde para que la matriz no se deteriore.
Un bolsillo en la forma de molde deseada se fabricará en la matriz extracelular. Para cargar las células concentrar la suspensión celular experimental después de la centrifugación en el medio de cultivo celular experimental apropiado e inyectar las células en el bolsillo dentro de la matriz extracelular. Coloque el cubo en la incubadora de dióxido de carbono durante 20 minutos a 37 grados Celsius para permitir que las células caigan en el bolsillo de la matriz extracelular, llenando el espacio creado por el micromolde.
Al final de la incubación, coloque el cubo en un pozo de una placa de 24 pozos y agregue 100 microlitros del medio de cultivo celular apropiado al pozo. Inyecte matriz extracelular adicional para cerrar el bolsillo y devolver el cubo a la incubadora durante 25 minutos. Cuando se cura la matriz extracelular, deja caer aproximadamente 10 microlitros de 20 grados Celsius agarrose sobre la superficie superior del cubo para cerrar la superficie y curar la caída durante 10 a 20 minutos a 37 grados celsius.
Luego cubre todo el cubo con medio fresco para promover la presión osmótica para facilitar la transferencia de nutrición a las células dentro del cubo. Para el reconocimiento de formas 3D no invasivo mediante observación multidireccional, coloque la placa en una etapa del microscopio y obtenga imágenes de cada lado del cubo mediante una microscopía de contraste de fase o de campo brillante, utilizando pinzas para rotar el servicio de cubo que se va a tomar imágenes entre capturas. Para la toma de imágenes inmunofluorescentes por observación multidireccional, primero aspirar el sobrenadante del pozo que contiene el cubo y fijar el cubo en 4%paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la fijación, lave el cubo dos veces con PBS durante 10 minutos por lavado. Impermeabilizar el cubo con 0.5%tritón x-100 y PBS durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, lave el cubo tres veces en PBS durante 10 minutos por lavado, antes de bloquear cualquier unión inespecífica con suero de cabra y tampón de inmunofluorescencia durante 60 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, manche las células con el anticuerpo primario adecuado de interés de acuerdo con los protocolos estándar de tinción de anticuerpos. A continuación, imagine los seis lados del cubo en un microscopio láser o fluorescente como se acaba de demostrar. En este experimento representativo, las imágenes multidireccionales de cubos de gel híbridos, cultivadas con células epiteliales bronquiales humanas normales, demuestran la generación de un cultivo celular cilíndrico o en forma de prisma inicial por contraste de fase e imágenes inmunofluorescentes de los cultivos.
Aquí se muestra la tinción inmunodemos de células epiteliales humanas normales inicialmente controladas a una forma cilíndrica en el cubo de gel híbrido, después de la generación del árbol bronquial. Las ramas muestran la perpendicular al eje cilíndrico, como se revela por imágenes multidimensionales. Es importante inyectar una alta densidad de células en el bolsillo de la matriz extracelular, ya que una baja densidad de células puede resultar en el deterioro de esa calidad celular después de la incubación.
Este patrón de método es la formación repetible de un patrón celular 3D con una medición cuantitativa por imágenes multidireccionales para estudiar el mecanismo de desarrollo de platos.
