Es necesario un método preciso y de alto rendimiento para medir los anticuerpos neutralizantes del VHS, como un marcador importante de protección contra el virus respiratorio sincitial. Este método es altamente reproducible con variaciones entre ensayos para el antisuero de referencia que son inferiores al 10%Creemos que este ensayo se puede establecer fácilmente en muchos laboratorios de todo el mundo a un costo relativamente bajo. Aquí describimos un ensayo de microneutralización basado en imágenes que se ha probado en el subgrupo A del RSV, y también se puede adaptar para el subgrupo B del RSV y diferentes tipos de muestras.
Demostrando el procedimiento estará Reuben Tse, miembro del equipo de investigación de MCRI. Para sembrar placas en el primer día, primera resuspendición A549 células en medios DMEM, con 10%FCS y 1.000 unidades de mezcla de penicilina-estreptomicina a una concentración de 400.000 células por mililitro. Luego siembra placas estériles de fondo plano de 96 pozos con 40.000 células A459 a una densidad de 100 microlitros por pozo.
Incubar la placa a 37 grados centígrados en un 5% de carbono durante la noche. Para preparar la dilución sérica en el segundo día, primero descongele las muestras de suero de referencia RSV y de prueba sérica humanas a temperatura ambiente. Luego colóquelos en un baño de agua a 56 grados centígrados durante 30 minutos para calentarlos y activarlos.
A continuación, prepare más de 110 microlitros de una dilución de uno a 100 del suero de referencia mezclando 1,5 microlitros del suero de referencia con medios DMEM libres de FCS con mezcla de penicilina-estreptomicina en un volumen final de 150 microlitros. Pipetear 110 microlitros de esta dilución en el pozo A12 de una placa estéril de fondo en U de 96 pocillos. Para hacer en serie de una a dos diluciones en la placa, primero agregue 55 microlitros de medios DMEM libres de FCS con mezcla de Penicilina-Estreptomicina a los pozos B12 a H12.
A continuación, con una nueva transferencia de punta 55 microlitros de pozo A12 a pozo B12. Pipetear hacia arriba y hacia abajo cinco veces para mezclar la solución, y continuar hasta que llegue bien a H12. Pipetear el exceso de 55 microlitros de la solución desde el pozo H12.
A continuación, prepare una dilución de una a 100 muestras de prueba sérica y agregue 110 microlitros de cada dilución a los pozos correspondientes A1 a A9 y E1 a E9 de la placa estéril de 96 pocillos. A continuación, agregue 55 microlitros de medios DMEM libres de FCS con mezcla de penicilina-estreptomicina a los pozos en las columnas uno a nueve. Haga la serie de una a dos diluciones de la fila A a la fila D y de la fila E a la fila H como se describió anteriormente.
Agregue 55 microlitros de medios DMEM libres de FCS con mezcla de penicilina-estreptomicina a los pozos de las columnas 10 y 11. Para preparar el stock de virus, primero coloque un vial congelado de RSV en un baño de agua Celsius de 37 grados para descongelarlo rápidamente, luego coloque el vial sobre hielo. A continuación, añadir el virus al medio DMEM que contiene mezcla de penicilina-estreptomicina a aproximadamente 200 PFU por pozo para hacer un volumen total de 55 mililitros para 100 pozos.
Para preparar la mezcla de suero del virus, primero agregue 55 microlitros del virus diluido a todos los pozos de las columnas uno a nueve y los pozos de las filas E a H de las columnas 10 y 11. A continuación, agregue 55 microlitros de medios DMEM libres de FCS con mezcla de penicilina-estreptomicina a todos los pozos de las filas A a D de las columnas 10 y 11, e incubar la placa a 37 grados Celsius en un entorno de dióxido de carbono al 5% durante una hora. Antes de la inoculación de células A549 con RSV, examine la placa celular bajo un microscopio de luz para confirmar que las monocapas de células A549 son 80%confluentes.
A continuación, invierta la placa suavemente para desechar el soporte, y borre ligeramente la placa sobre una toalla de papel absorbente estéril. Después de cada uno, lavar con PBS estéril filtrado. A continuación añadir 100 microlitros por pozo de la mezcla de suero del virus a los pozos correspondientes en la placa celular A549 de acuerdo con la plantilla de placa proporcionada en el manuscrito, e incubar la placa a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono durante una hora.
Al final de la incubación, utilice una pipeta para eliminar 90 microlitros por pozo, y agregue 100 microlitros de los medios que contienen 1XM199, 1.5%CMC, y 2%FCS en la mezcla de Penicilina-Estreptomicina. Incubar la placa a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante tres días. Para fijar y desarrollar una placa de ensayo, primero invierta suavemente la placa celular A549 infectada por RSV para desechar los medios que contienen M199, CMC, 2%FCS y la mezcla de penicilina-estreptomicina.
A continuación, agregue lentamente 200 microlitros de búfer de fijación a cada pozo. Incubar la placa a menos 20 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, deseche el tampón de fijación y borre suavemente una toalla de papel absorbente.
Deje que la placa se seque boca abajo durante 10 minutos. A continuación, con el búfer PBS filtrado que contiene 05 polisorbato 20, haga una solución de bloqueo de leche al 5%. Añadir 200 microlitros de la solución de bloqueo a cada pozo e incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Al final de la incubación invierta la placa suavemente para desechar la solución y borre una toalla de papel absorbente. Para fabricar el anticuerpo primario, diluya de una a 500 cabras XRSV en la solución de bloqueo. Añadir 50 microlitros a cada pozo e incubar la placa a 37 grados Celsius durante una hora.
Lave la placa tres veces con el polisorbato DE PBS filtrado. A continuación, haga el anticuerpo secundario diluyendo de uno a 5 000 Alexa Fluor burro anti-cabra inmunoglobulina G en la solución de bloqueo. Añadir 50 microlitros a cada pozo e incubar a 37 grados Celsius durante una hora.
Lave la placa cinco veces con polisorbato PBS filtrado. Para contar placas con un lector de manchas automatizado, utilice primero una placa de cultivo de 96 pozos sin usar para colaborar con el instrumento introduciendo los ajustes de recuento en el canal FITC. Luego lea la placa celular, envuélvala en papel de aluminio y guárdela a cuatro grados centígrados.
A continuación, compruebe las imágenes de pozos en busca de placas artefactos o monocapas de células alteradas, y excluya los pozos con monocapas de células alteradas. El número medio de placas de los pozos de control sin suero se calculó y se utilizó para determinar el corte de neutralización del 50% que resultaría en una inhibición del 50% de la actividad del virus. La dilución suricada recíproca se trazaba en el eje X y el número de placas en el eje Y de un gráfico semi-log a partir de una línea dibujada entre los dos puntos.
Los títulos de neutralización del 50% de las muestras de suero de prueba fueron de color rojo y se identificaron diluciones séricas con recuentos inmediatamente superiores o inferiores al valor del 50% de los pozos de control sin suero. Los ensayos de RSVAPRN en dos cohortes adultas diferentes de Gambia y voluntarios sanos en Melbourne dieron como resultado que los adultos de Gambia tuvieran un título NAB medio más bajo en comparación con los adultos de Melbourne. El suero humano de referencia RSV mostrado demuestra una variabilidad muy baja con el coeficiente de variación del 6,82%Este ensayo mejorado de neutralización de la reducción de la placa RSV de alto rendimiento se puede implementar fácilmente en muchos laboratorios, y apoyará el esfuerzo de armonización internacional de la OMS para ensayos de anticuerpos neutralizantes del RSV.
Esto será fundamental para la evaluación de nuevos candidatos a vacunas contra el RSV en el futuro.
