Profesör Anders Jeppsson kan damarlarının deneylerde kullanılan sağlama konusunda yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma finanse LUA ALF hibe SSH.

Doku kullanılan ve bu kağıt Protokolü Göteborg Üniversitesi etik kuralları izler.
1. doku hazırlık ve depolama
<ol><li>Cerrahi forseps ve makas kullanarak alınan safen ven çevre dokudan kesin. Not: Safen ven insanlar alt ekstremite damar cerrahları tarafından disseke. Bu yazıda kullanılan safen ven bypass cerrahisi sonra un kullanılan bir parçasıdır.</li>
	<li>Perfüzyon sırasında kaçağı önlemek için kendi amaçları dikişler ve forseps ile tüm yan şubelerinde ligate.</li>
	<li>Ven fosfat tampon salin (PBS) 40 mL içeren bir 50 mL tüp içinde tutun. Ven aşırı kan kaldırmak için PBS 2 - 3 kez değişiklik yaparak yıkayın. Ven-80 ° C'de dondurarak saklamak</li>
</ol>2. Decellularization kurulumları ve Recellularization biyoreaktör hazırlanması
Not: makas kullanarak, Tablo 1' de gösterildiği gibi silikon tüpler kesti.
<ol><li>
Decellularization kurulumu 1 (Triton X-100 perfüzyon ve yıkama)
	<ol>
<li>Bir 2 L (plastik küvet) odası, tüp Şekil 1A' gösterildiği gibi A tüm üç adet bant. Not: teyp nerede odası (deterjan'ın giriş) alt kenarına dokunur bir duvar için bir tüp ve diğer iki tüp ven uzunluğuna bağlı olarak 5-10 cm arasında bir mesafe ile karşı duvara. En az 5 cm Bu tüpler de odası 's yere (damar'ın giriş ve çıkış) bantlanmış.</li>
		<li>Erkek ve dişi radarı bağlayıcılar, kullanarak bağlan serisinde tüp için tüp B F, tüp C tüp tarafından takip deterjan'ın giriş ve sonunda damar giriş için. Yer ve peristaltik kaset tüpüne F ben pompa.</li>
		<li>Başka bir tüp C al ve bir ucunu damar'ın prize bağlayın. Diğer ucunu 45 cm (deterjan çıkış) odası yerleştirilir alt hortum çıkış ile cam kavanoza yerleştirin ve güvenliğini sağlamak için Kaydet. Tüp G alın ve bir ucu cam kavanoz hortum çıkış itmek ve diğer ucunu ven odanın içine yerleştirin. Not: Tüm kurulum (kırmızı oklar), odası ve akış yönünü (beyaz ok) resimlerini Şekil 1Aile gösterilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization kurulum 2 (için TnBP perfüzyon)
	<ol>
<li>1 L cam sürahi alıp tüp jar'ın alt dokunuyor kadar tüp C (deterjan giriş) bir ucunu kavanoza yerleştirin.</li>
		<li>Tüp F tüp tarafından C. yer tüp C diğer ucunu kavanozun içine yarım Derinlik (damar'ın giriş) kadar takip için diğer ucunu bağlayın. Tüp F peristaltik pompa kaset yerleştirin ben.</li>
		<li>Tüp D alın ve bir ucu kavanoza (damar'ın çıkış) yarım derinlik ve diğer ucunu cam kavanoza kadar damar'ın giriş (deterjan çıkış) 45 cm yükseklikten yer alt hortumu ile yerleştirin. Güvenliğini sağlamak için deterjan'ın giriş ve çıkış boruları teyp.</li>
		<li>1 L cam sürahi bir manyetik karıştırıcı yerleştirin ve mıknatıs şişe içinde tutmak.</li>
		<li>Tüp G alın ve bir ucu cam kavanoz hortum çıkış üzerine itmek ve diğer ucunu 1 L cam sürahi yerleştirin. Not: Resim tam kurulumu (kırmızı oklar), Şekil 1Badımında odası ve akış yönünü (beyaz ok) gösterilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization Kur 3 (için DNaz perfüzyon)
	<ol>
<li>250 mL Cam şişe alın ve her iki ucunda da tüp C. yer tüp ortasındaki alanı peristaltik pompa II kaset yerleştirin. Not: Tüp bir ucunu çözüm giriş ve tüp diğer ucunu damar'ın koya bağlı. Damar'ın çıkış çözümde serbest bırakılır.</li>
		<li>Pompa 37 ° C'de dahil olmak üzere tüm kurulum yerleştirin Kurulumu tamamlamak ve akış yönünde resmi Şekil 1 ciçinde gösterilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recellularization biyoreaktör
	<ol>
<li>Tüm parçaları Şekil 2Agösterildiği gibi hazır tutun.</li>
		<li>Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi 4-port kapağını ve her bağlantı noktasına takın, H (damar'ın çıkış) Tüp, tüp ben (medya giriş) ve J (damar'ın giriş) tüp. Tüp H diğer ucunu (medya çıkış) 4th bağlantı noktasına bağlayın. Not: 4-port kapağı üstten görünüm Şekil 2Ciçinde gösterilir. Tüpler, sivri bir makas ile kenarları kesilmiş kolay ekleme için.</li>
		<li>Diğer ucunu ise tüp J U şekle viraj ve dikiş ile kravat. Azalan bakiyeli bağlayıcılar tüpler H & J. iç ucuna bağlayın</li>
		<li>60 mL tüp düz taban ile 250 mL Cam şişe içine yerleştirin ve yukarıda yapılan Kur Şekil 2Bolarak gösterildiği gibi tüp içine yerleştirin. Şekil 2Eiçinde gösterildiği gibi tüplerde K, E ve K serisi bağlayın. Bir tüp K damar'ın giriş ve medya giriş için başka bir tüp K bağlayın. Not: Kurulum ve akış yönü Şematik diyagramı Şekil 2Fiçinde görülür.</li>
		<li>Biyoreaktör tarafından ısıyla sterilize.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hazırlık çözümleri
<ol><li>Çözüm 1 (10 x su): için 1 L Ultrasaf Su, 2 g sodyum azid ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 18.6 g ekleyin. Tuz eriyene kadar karıştırın.</li>
	<li>Çözüm 2 (1 x su): 100 mL çözeltisi 1 alın ve 900 mL ultrasaf su ekleyin.</li>
	<li>Çözüm 3 (Triton X-100 x 5): Triton X-100 50 mL, 1 g sodyum azid ve 9.3 g EDTA Ultrasaf Su 950 mL için ekleyin. Eriyene kadar karıştırın.</li>
	<li>Çözüm 4 (Triton X-100 x 1): 200 mL çözüm 3 alın ve 800 mL ultrasaf su ekleyin.</li>
	<li>Çözüm 5 (1 x TnBP): TnBP 10 mL 10 mL pipet ile çözüm 2 990 mL için ekleyin.</li>
	<li>Çözüm 6 (40 Kunitz adet/mL DNaz): DNaseI, 2.000 Kunitz eklemek biriminde Dulbecco'nın fosfat tampon CaCl2 ve MgCl2içeren serum 50 mL. Taze hazırlamak ve hemen kullanın.</li>
	<li>Çözüm 7 (PBS): 24 g sodyum klorür, potasyum klorür 0.6 g, 4,32 g sodyum fosfat ve potasyum fosfat 0,72 g için 3 L ultrasaf su ekleyin. Eriyene kadar karıştırın. PH 7.4 için ayarlayın. 1 litre PBS Otoklav içinde sterilize ve ayrı ayrı saklayın.</li>
	<li>Çözüm 8 (% 0,1 Perasetik asit): 50 mL steril çözüm 7, 50 µL Perasetik asit ekleyin. Taze hazırlamak ve hemen kullanın.</li>
</ol>4. endotel orta hazırlanması
<ol><li>L-glutamine, 5 mL 5 mL anti-anti, insan AB serumu 50 mL ve 500 ml steril bir başlık altında MCDB131 orta fetal Sığır serum dışında EGM-2 büyüme faktörü kitinin tüm bileşenleri de ekleyin.</li>
</ol>5. safen ven decellularization
<ol><li>İnsan safen ven-80 ° c oda sıcaklığında erimek. Tekrar-80 ° C'de donmasına ve yine oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>Biyopsi makas kullanarak 2 mm uzunlukta Kes ve formaldehit oda sıcaklığında 24-48 h için düzeltin. Damar dikiş ile erkek ve dişi radarı bağlayıcı barbs için her iki ucuna bağla.</li>
	<li>Ven decellularization Kur 1 bağlanmak ve çözüm 2 1 litre doldurun. 15 dk 35 mL/dak., boş için kurulum içeriğini sıvı.</li>
	<li>Çözüm 4 1 litre ekleyin ve 4 35 mL/dak. s kurulum içeriğini boşaltmak için sıvı.</li>
	<li>Çözüm 2 500 mL ekleyin ve 5 dk. boş için kurulum içeriğini sıvı. Bu adımı yineleyin. Ven perfüzyon kurulumundan 1 çıkarıp perfüzyon kurulum 2 takın.</li>
	<li>Çözüm 5 1 litre ekleyin, karıştırıcı üzerinde açmak ve 35 mL/dk 4 h için sıvı. Not: Çözüm 5 dönüm karıştırıcı ve perfüzyon boyunca sonra bulanık.</li>
	<li>Ven perfüzyon kurulumundan 2 kesin ve 5-10dk Ultrasaf Su 4 değişiklikleri damar'ın iç ve dış şırınga veya 10 mL pipet ile yıkayın.</li>
	<li>Perfüzyon Kur 3 damar bağlanmak, çözüm 6 50 mL ekleyin ve 10 mL/dk 37 ° C odasında 4 h kurulum içeriğini boş ve damar kurulumundan kesmek için sıvı.</li>
	<li>Ven perfüzyon Kur 1 bağlanmak, çözüm 2 1 litre doldurmak ve gecede 35 mL/dak. tekrarlamak adım 5.4 ile adım 5,9 4 kez (için toplam 5 döngüleri), sıvı. Adım 5.2 belirtildiği gibi tekrar biyopsi alın. Not: Atla adım 5.8 ikinci bölümü döngülerle 1 ve 3.</li>
	<li>Belgili tanımlık tertibat içeriğini temizleyin. Çözüm 2 1 litre doldurun ve sıvı 24 h 35 mL/dak değişikliği çözüm için 2'den sonra 12 h. Kur içeriğini temizleyin. 1 L ultrasaf su doldurun ve 35 mL/dak değişiklik Ultrasaf Su 24 h için kurulum içeriğini sonra 12 h.Empty sıvı. Çözüm 7 1 L doldurun ve sonra 12 saat 7 24 h 35 mL/dak değişikliği çözüm için sıvı.</li>
</ol>6. Decellularization doğrulanması
<ol><li>Biyopsi standart protokolleri takip bir doku işlemci işlem 15 dakika süreyle Ultrasaf Su sabit formalin yıkayın ve parafin22embed.</li>
	<li>Bir microtome kullanma 5 µm bölümlerine kesmek ve leke Meyer Hematoksilen ve % 0,2 alkollü eozin (H & E) ile aşağıdaki standart protokolleri22.</li>
	<li>Çekirdekler için normal doku karşılaştırıldığında decellularized doku kaybı olup olmadığını denetlemek için mikroskop altında görüntüleyin.</li>
</ol>7. recellularization
<ol><li>Ven çözüm 8 50 mL içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirerek sterilize. Shaker 37 ° C'de 1 h için (devir/dakika) dakikada 80 rotasyonlar, kışkırtmak</li>
	<li>Laminar akış (SMD) andan itibaren kısırlık korumak için kabin altında ven başa. 50 mL steril çözüm 7 ve 500 µL anti-anti, içeren yeni bir 50 mL tüp için steril forseps kullanarak ven aktarın. Yukarıdaki gibi 12 h. değişiklik çözüm 7 en az iki kez arasında için tahrik.</li>
	<li>Steril forseps kullanarak, yeni bir 50 mL tüp ven aktarmak ve endotel medya 50 mL ekleyin. Yukarıdaki gibi 11 h için tahrik.</li>
	<li>SMD Kabin altında steril eldiven kullanarak biyoreaktör bir araya getirin. Ven biyoreaktör'ın damar giriş ve çıkış steril dikiş ve forseps ile için kravat.</li>
	<li>Ven biyoreaktör ve dolgu aynı orta ile bağlayın. 50 IU/mL heparin ekleyin ve 2 mL/dk 37 ° c 1 h için sıvı</li>
	<li>Heparin kaplı tüp tüpler donörden 15-25 mL taze kan (bağlı olarak damar'ın uzunluğu) toplamak ve Steen çözüm ile 1:1 oranında seyreltin. Daha sonra endokrin bezi kaynaklı vasküler endotelyal büyüme faktörü (EG-VEGF, 80 ng/mL), temel fibroblast büyüme faktörü (FGF-b, 4 µL/mL) ve asetil salisilik asit (5 µg/mL) ekleyin.</li>
	<li>37 ° C kuluçka %5 CO2 biyoreaktör taşımak ve 2 mL/dk 48 h için sıvı.</li>
	<li>Yaklaşık 12 h sonra biyoreaktör bir LAF dolap, hareket bir damla kan al ve kullanarak izleme cihazı bir kan şekeri glukoz ölçümü. Düzeyi daha az 3 mmol/L ise, glikoz getirmek için eklemek 7-9 mmol/l yineleme aralığı içinde bu adım her 8-12 h.</li>
	<li>48 h sonra biyoreaktör LAF kabin taşımak ve biyoreaktör kandan drenaj. 30 mL steril çözüm 7 ekleyin ve 5 dk. drenaj çözüm sıvı. 30 mL steril çözüm 7 ekleyin ve 5 dk. tekrar iki kez veya kan kırmızı renk kaybolur kadar sıvı. Not: Hücre ek doğrulama için biyopsi alınabilir. Damarı kesmek, ven 5 mm kenarları makasla kesmek ve onları atın. 5.2. adımda belirtildiği gibi bir biyopsi almak ve damar yeniden biyoreaktör (isteğe bağlı adım) bağlanın.</li>
	<li>Endotel orta 30-45 mL ekleyin ve 2 mL/dk kuluçka 96 h için sıvı. Not: endotel orta damarı batık kadar ekleyin.</li>
	<li>Biyoreaktör LAF kabinin taşımak, recellularized damar bağlantısını kesin, makas kullanarak ven 5 mm kenarları kesilmiş ve atmak. Biyopsi 5.2. adımda belirtilen şekilde alın.</li>
</ol>8. Recellularization doğrulanması
<ol><li>6 bölümündeki yönergeleri izleyin ve H & E boyama gerçekleştirmek. Slaytları hücrelerin varlığı için mikroskop altında incelemek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brockbank, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+upon+vein+function+in+vivo.">Effects of cryopreservation upon vein function in vivo.</a> Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).</li><li>O'Donnell, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+operative+findings+with+angiographic+and+noninvasive+hemodynamic+factors+associated+with+failure+of+polytetrafluoroethylene+grafts.">Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts.</a> Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).</li><li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li><li>Raya-Rivera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction:+an+observational+study.">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells:+a+proof-of-concept+study.">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Application+of+Tissue-Engineered+Veins+Using+Autologous+Peripheral+Whole+Blood:+A+Proof+of+Concept+Study.">In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study.</a> EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).</li><li>Conconi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+matrices,+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method,+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells.">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).</li><li>Zhang, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+human+fetal+mesenchymal+stem+cells+for+off-the-shelf+bone+tissue+engineering+application.">The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application.</a> Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).</li><li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers.">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).</li><li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration.">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Science Reports. 4, 6716 (2014).</li><li>Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs:+Current+Problems+and+Future+Directions.">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).</li><li>Young, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+the+eyes+of+an+immunologist.">Endothelial cells in the eyes of an immunologist.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).</li><li>Graham, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+seeding+of+prosthetic+vascular+grafts:+early+experimental+studies+with+cultured+autologous+canine+endothelium.">Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium.</a> Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).</li><li>Onuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+endothelialization+model+for+the+study+of+Dacron+graft+healing.">Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing.</a> Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).</li><li>Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+arterial+graft+healing.+Rapid+transmural+capillary+ingrowth+provides+a+source+of+intimal+endothelium+and+smooth+muscle+in+porous+PTFE+prostheses.">Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses.</a> American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+completely+biological+engineered+grafts+following+decellularization+into+the+sheep+femoral+artery.">Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+exercise+and+body+position+on+the+venous+pressure+at+the+ankle+in+patients+having+venous+valvular+defects.">The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects.</a> Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+peptides+derived+from+extracellular+matrix+as+chemoattractants+for+primary+endothelial+cells.">Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells.</a> Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).</li><li>van Ark, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes+mellitus+is+associated+with+an+imbalance+in+circulating+endothelial+and+smooth+muscle+progenitor+cell+numbers.">Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers.</a> Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).</li><li>Steen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+lungs+from+a+non-heart-beating+donor.">Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor.</a> Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).</li><li>Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+lung+perfusion.">Ex-vivo lung perfusion.</a> Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).</li><li>Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+and+VEGF+function+in+angiogenesis:+signalling+pathways,+biological+responses+and+therapeutic+inhibition.">FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition.</a> Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).</li><li>Peplow, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor-+and+cytokine-stimulated+endothelial+progenitor+cells+in+post-ischemic+cerebral+neovascularization.">Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization.</a> Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).</li><li>Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+improves+proliferation+and+differentiation+of+endothelial+progenitor+cells+via+upregulating+VEGF+generation.">Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation.</a> Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).</li><li>Dragoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+stimulates+endothelial+colony+forming+cells+proliferation+and+tubulogenesis+by+inducing+oscillations+in+intracellular+Ca2++concentration.">Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration.</a> Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).</li><li>Sai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+is+essential+to+maintain+endothelial+progenitor+cell+phenotype+in+TR-BME2+cells.">Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).</li><li>Gallus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspirin+and+other+platelet-aggregation+inhibiting+drugs.">Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs.</a> Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).</li></ol>

SSH tutar Verigraft, kan damarlarının mühendislik doku teknolojisini lisanslı bir şirket hisse. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.

Safen damarlar decellularization için burada sunulan teknik umbilikal ve meme damarlar gibi tüm küçük çaplı damarlar için uygulanabilir kolay, basit ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Decellularization çözümleri ve bu yöntemde kullanılan onların konsantrasyonları bizim önceki sonuçları6,7' den vardır. Decellularization 5 döngüleri öneririz rağmen bazı damarlarda biz de 3 kür tam decellularization fark ettim. Ancak, tekrarlanabilir sonuçlar 5 döngüleri kullanarak elde edilmiştir. Bu iletişim kuralı uygulayarak, biz uzunlukları değişen damarları decellularized 30 cm'ye kadar başarıyla (yayınlanmamış sonuç). Decellularization çözümün çıkış tarafından 45 cm kaldırma 33 mmHg ven içinde basınç oluşturur. Deneyim, biz bütün damar düzgün decellularizing ve tekrarlanarak 5 döngüleri önemli bir adım olarak bu fark. Seçilen basınç normal safen ven basınç (5-10 mmHg) 3 kat daha yüksek ama yetersiz olduğu (varis)23damarlar. Ayrıca, bu yüksek basınç önemli bir güç damar duvarlarında oluşturur ve bu nedenle, verimli ve daha hızlı hücre kaldırılmasına yardımcı olabilir spekülasyon.
TnBP bir organik çözücü ve suda çözünmez olduğundan, deterjan bulutlu hale gelinceye kadar karıştırarak önemlidir; Aksi takdirde, deterjan yüzer olacak. Aynı nedenle, hortum çıkış ile cam kavanoz üstündeki deterjan'ın çıkış tüp çözümde, karışık TnBP tutmak için yerleştirildi. TnBP verimli kaldırılması damardan sonra onun kullanım her döngüsünde TnBP damlacıkları yıkanmış suda yüzen yokluğu tarafından görülebilir. Ayrıca DNaz adım atlama da decellularized bir doku üretti ama birkaç durumlarda, decellularized doku nispeten yüksek bir DNA içeriği fark etmişsinizdir. Yüksek basınç ve yüksek akış oranları verimli DNaz etkinlik için gerekli değildir, bir düşük perfüzyon oranı (10 mL/dak) kullanılabilir. Onun küçük boyutta kurulumu kolay İşlemede yardımcı olarak farklı peristaltik pompa kullanıldı. Çoğu hücre hasarı dönemi 2 sonuçlarında decellularization sırasında fark ettik beri DNaz tedavi döngüleri 1 ve 3 (yayınlanmamış sonuç) sırasında atlama öneririz. Karakterizasyonu ve miktar hücre dışı matriks proteinleri bu el yazması yapıldı değil olsa bile, bizim önceki deneyim benzer decellularization protokollerle biyomekanik özellikleri korunması gösterdi, hücre dışı matriks7yapısı ve proteinler. Bu damarlar ile bizim ön miktar deneyler (yayınlanmamış) benzer bir sonuç üretilen rağmen zaten yayınlanmış sonuçlarımız bu güven güçlendirecektir.
Bir önlemek uzun hücre genişletme kez, genişletilmiş hücreleri, cerrahi işgali ve rahatsızlık spontan mutasyonlar hasta için kan kullanarak recellularization bir rahat ve kolay kemik iliği genişletilmiş hücrenin üzerine işlemdir. Bu bilinen beri endothelialization da EPCs dolaşan oluşabilir, biz o perfüzyon ile endotel orta perfüzyon ardından kan ile olan recellularization için yeterli olacaktır. İki tür damarlar ile ekstra hepatik portal damar tıkanıklığı7çocuk içine implante edildi Emanet benzer bir yöntemle mühendislik ven dokuların nakli başarılı sonuçlarından görülür. Decellularized hücre dışı matriks içinde büyüme faktörleri EPCs kan24dolaşan eki verecektir spekülasyon. Recellularization benzer bir protokol sonrası damar hücreleri VEGF reseptör-2 ve farklılaşma (CD) 14 lümen CD45 ifade hücreleri adventitia7' de görüldü ise küme için olumlu gösterdi. Ayrıca sürekli endotel katman her durumda bu kişilerin progenitör hücre25dolaşan numaraları azalma Bilindiği gibi özellikle büyük ve hastalıklı hastalardan kan ne zaman istimal gözlenen değil ki hayal. Ancak, biz bu perfüzyon ile alıcının kendi önermeyi kan yüzünden decellularization maruz kalır ve böylece olumsuz inflamatuar reaksiyonları sadece dikim yerine nakledilen olasılığını azaltmak antijenleri pek çok maske decellularized kan damarları. Buna ek olarak, kan perfüzyon büyüme faktörleri lümen ve hangi sırayla recellularization vivo içindehızlı bir işlemde ortaya çıkan progenitör hücre dolaşımdaki artan numaraları işe olabilir adventitia, daha yüksek düzeyde yatırabilirsiniz.
Bu çalışmada kullanılan biyoreaktör tasarım avantajı tam Isıyla, kolay montaj, maliyet-etkililik, kolay kullanım ve en az zarar olasılığı vardır. Deneyim, dakikada 10 cm uzunluğunda recellularized geçerli Tasarım, damarları kullanarak. Düz-se bile kadar damarları 25 cm uzunluğunda de recellularized damar "U" şeklinde biyoreaktör içinde tutarak, bu doğrulanması gerektiğini. Biyoreaktör Tasarımı ven akış yönünü yerçekimine karşı ve normal insanlarda bu damarlar için akış yönünü olduğundan bu nedenle tasarlanmıştır gösterilmiştir. Endotel orta adım 12 h perfüzyon ven yaygõn ve gelen EPCs eki benzeşim artırmak olduğunu. İlave heparin ve perfüzyon 1 h için eklenmesi kan pıhtıları kan perfüzyon sırasında tüplerde şekillendirme riskini düşürür.
Gerekli kan kan hacmi damarın uzunluğuna bağlıdır. Damar içinde kan sokulmasına biz kan hacmi için takip temel ilkedir. Kan 45 mL büyük birimler işlerken, ara sıra karıştırma biyoreaktör alt hücre birikimi önlemek için gerekli olabilir. Biz Steen'ın çözüm yüksek miktarda protein ve dokuların sağlıklı organ nakli26,27sırasında korumak için gerekli bileşenler içerdiğinden kan için ekledi. VEGF ve b-FGF ek olarak onlar güçlü anjiogenik büyüme faktörleri28 ve geçiş, yayılmasını önleme ve EPCs29,30,31,32 farklılaşma varlıklarını indükler faydalıdır . Eklendi VEGF miktarı EPCs yayılması 80 ng/mL nerede görülmüş önceki yayınlanmamış sonuçlarımız temel alır. Aspirin ilavesi böylece endotel tabakası kendi eki olasılığını azaltarak trombosit33 aktivasyonu engeller. Sürekli izlenmesi ve glikoz ilavesi de hücre çoğalması ve hemoliz kırmızı kan hücrelerinin önlenmesi için faydalı olacaktır.
Sadece basit kan örneği alıcıdan gelen gerekli olduğu için daha az teknik uzmanlık gerektiren bir kolay ve uygulanabilir prosedür olarak kabul edilebilir. Burada bitirmek için baştan gösterilen tüm prosedürü 20 gün alır rağmen, decellularized damarlar olarak saklamak bir raftan ürün hastalar için 8 gün yordamına kısaltacaktır. Decellularized damarlar depolanmasını Teknik olarak recellularization verimliliği etkilememelidir rağmen değerlendirilmelidir. Aşağıdaki yordamı oluşturulan doku mühendisliği damarları tıkalı damarlar, varis bağışıklık suppression gerek kalmadan önde gelen ve böylece daha iyi bir kalite sağlayan venöz yetmezlik yerine bypass ameliyatları için klinikte kullanılabilir hayat hasta için.

Vasküler kanallar gibi anevrizma, karotid arter stenoz ve ateroskleroz ciddi vasküler sorunlar için önde gelen birkaç klinik koşulları için gereklidir. Cerrahlar otolog, allojeneik veya sentetik vasküler kanallar fonksiyonel kan akımı geri yüklemek için kullanın. Otolog kan damarları kullanımı hala ideal yaklaşım olarak kabul rağmen hastalarda oldukça sınırlı olduğunu. Allojenik veya sentetik Greftler gibi alternatifleri immünsüpresif tedaviler ve zavallı açıklık reoperation1,2önemli sağlık ülkelere ekonomik yükleri kaynaklanan, önde gelen derin sorunları var. Doku mühendisliği kan damarlarının doğal Homoloji ve otolog hücrelerin Greftler sunmayı amaçlamaktadır. Böylece, alıcı bağışıklık sistemi transplante greft kendini olarak tanır ve böyle bir greft doğal proteinler ve özgün yapılandırmayı hücrelerde içerdiğinden, daha iyi geçerli alternatifleri ile karşılaştırıldığında işlev. Mesane3, üretra4, nefes borusu5ve damarlar6,7, başarıyla klinikte kullanılmış gibi doku organları, mühendislik.
Kişiselleştirilmiş Greftler üretmek için doku mühendisliği bir greft decellularization ve recellularization ardından bir donörden gerektirir. Decellularization hücreleri doku ve organların8,9,10' dan kaldırmak için umut verici bir teknolojidir. Decellularization belirli fiziksel, kimyasal ve enzimatik Yöntemler11 veya bunları birleştirerek tarafından gerçekleştirilebilir. Bu yöntemlerin en uygun kullanımı decellularized dokularda benzer yapısal ve işlevsel proteinler bir hücre dışı matriks yerli dokulara benzer olabilir. Böyle organları eki, geçiş, yayılması ve gelen kök hücre farklılaşma geliştirmek iç kapasitesine sahip.
Recellularization hücre greft tohum dinamik bir süreçtir ve alıcı kök hücre klinik ekimi için kullanılabilir. Şu anda bu tür amaçlar için kullanılan kök hücreler kemik iliği, mezenkimal ve organ sakinleri3,5,6içerir. Hayvan ve araştırma odaklı çalışmalar fetal ve indüklenmiş pluripotent12,13,14vardır mezenkimal kökenli kök hücrelerden kullandık. Bu işlem bir biyoreaktör (damarı tutar ve sıcaklık, gazlar, pH ve basınç gibi gerekli koşulları sağlayan bir odası) gerektirir hücreleri ve Kültür medya. Recellularization mücadelesine hücreleri belirli bir türü ve hangi tarafından bütün doku veya organ hücreleri ulaşabilirsiniz tohum bir strateji gerekli sayıda elde etmektir. Rağmen hiçbir tam doku veya organ yapısal ve işlevsel olarak yapılmış oluşturulan ve şimdiye kadar birkaç gelişmeler alan ve ilk sonuçları gelecekteki olasılığı15göster değerlendirildi. Ven tuşu fonksiyonu iltihabi hücre infiltrasyonu doku ve daralma içinde yardımcı olur ve kan basıncı16tutmak için güç sağlar orta düz kas katmanı içine denetler luminal endotel yatıyor. Çalışmalar sırasında hasar, anastomoz veya dolaşan endotelyal progenitor hücreler (EPCs) kan17,18,19endothelialization oluştuğunu göstermiştir. Bizim strateji recellularization damarlar için kan dolaşan mevcut EPCs kullanır.
Doku mühendisliği damarları ve arterler farklı decellularization recellularization stratejileri20,ve21takip çeşitli gruplar tarafından gerçekleştirildi. Grubumuz aynı zamanda gerçekleştirilen ve iliak ve meme damarlar6,7için decellularization ve recellularization stratejiler geliştirdi. Decellularization Triton X-100, tri-n-butil fosfat (TnBP) ve enzim deoksiribonükleaz (DNaz) damarda ajitasyon tarafından gerçekleştirildi. Recellularization kemik iliği türetilmiş endotel ve düz kas hücreleri6 veya periferik kan7kullanılarak gerçekleştirildi. Ekstra hepatik portal damar tıkanıklığı6,7ile fonksiyonel kan akımı pediatrik hastalarda ekiminde sağlanmasında klinik vaat iki protokolü tarafından damarları recellularized.
Biz şu anda küçük çaplı damarlar decellularization, recellularization ve biyoreaktör işlenmesi kolay ve geliştirilmiş performans için aynı iletişim kuralını değiştirilmiş bir versiyonu geliştirdik. Geçerli decellularization iletişim kuralı deterjanlar ajitasyon deterjanlar ile yerine basınç uygulayarak ven yoluyla perfüzyon gerekli. Recellularization Protokolü Önkoşullanma hücre adezyon ve ek hücre adezyon, hayatta kalma ve yayılmasını önleme geliştirmek için kan dolaşan içinde büyüme faktörlerinin artırmak için ek bir adım içerir. Piyasada bulunan ürünleri kullanarak Biyoreaktör Tasarımı da iyileştirilmiştir. Bu yazıda, biz decellularization ve recellularization insan safen damar gerçekleştirmek için değiştirilmiş bir protokol ayrıntılı bir açıklama mevcut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">4-Port Cap</td>
			<td style="width:208px;">CPLabSafety</td>
			<td style="width:119px;">WF-GL45-4Kit</td>
			<td style="width:499px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Acetyl salicylic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Anti-Anti</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">B-FGF</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">cc-4113B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:333px;">Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td>
			<td style="width:208px;">Abbott</td>
			<td style="width:119px;">70808-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DNase-I</td>
			<td style="width:208px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2 Growth Factors Kit</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">EG-VEGF</td>
			<td style="width:208px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Glass bottle 250ml</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151593</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass bottle 1L</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151595</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td>
			<td style="width:208px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:119px;">14607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin</td>
			<td style="width:208px;">Leo</td>
			<td style="width:119px;">387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin Coated Vacutainer Tubes</td>
			<td style="width:208px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Human AB Serum</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 5/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-45518-06</td>
			<td>For 5X8mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">MCDB 131</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Per acetic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump I</td>
			<td style="width:208px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">7524-45</td>
			<td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump II</td>
			<td style="width:208px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM941</td>
			<td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td>
			<td style="width:208px;">Biotech</td>
			<td style="width:119px;">ISM569A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Shaker</td>
			<td style="width:208px;">Ika</td>
			<td style="width:119px;">KS4000 i&#160; control</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Steen solution</td>
			<td style="width:208px;">Xvivo</td>
			<td style="width:119px;">19004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Suture</td>
			<td style="width:208px;">Agnthos</td>
			<td style="width:119px;">14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tri-n-butyl Phosphate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16084.AU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tube 60ml with flat base</td>
			<td style="width:208px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">60596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube A</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube B</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube C</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube D</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube E</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube F</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube G</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube H</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube I</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube J</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube K</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Vasküler kanalların çoğu vasküler cerrahi sırasında kullanılan kez immünosupresyon ve zavallı a_ılabilinirse neden komplikasyonlara yol allojenik veya sentetik Greftler vardır. Doku mühendisliği doğal hücre dışı matriks decellularization ve recellularization yöntemini kullanarak alıcının hücreleri içeren kişiselleştirilmiş Greftler oluşturmak için yeni bir çözüm sunuyor. Biz insan safen ven ve recellularization decellularization periferik kan perfüzyon tarafından gerçekleştirmek için detaylı bir yöntemi gösterir. Ven ventriküler 1 oranında decellularized Triton X-100, % 1'tri-n-butil-fosfat (TnBP) ve 2.000 Kunitz birimleri deoksiribonükleaz (DNaz). DNaz 10 mL/dk 4 h için 37 ° C'de periosteum iken Triton X-100 ve TnBP 35 mL/dk 4 h için derin. Ven Ultrasaf Su ve PBS yıkanmış ve % 0.1 Perasetik asit sterilize edilmiştir. Tekrar PBS içinde yıkanmış ve endotel ortamda preconditioned. Damar bir biyoreaktör bağlı ve periosteum ile endotel orta 50 IU/mL içeren doldurmak biyoreaktör taze kan ile Steen çözüm seyreltilmiş 1:1 ve endokrin bezi kaynaklı eklemek için 1 h. Recellularization heparin gerçekleştirildi vasküler endotelyal büyüme faktörleri (80 ng/mL), temel fibroblast büyüme faktörleri (4 µL/mL) ve asetil salisilik asit (5 µg/mL). Biyoreaktör sonra bir kuluçka taşındı ve glikoz 3-9 mmol/l arasında koruyarak 2 mL/dk 48 h için derin Daha sonra damar endotel orta ile dolu ve PBS ile yıkanmış kuluçka 96 h için derin. Triton X-100, TnBP ve DNaz ile tedavi 5 döngülerle safen ven decellularized. Decellularized ven normal ve recellularized damarlar (ışık kırmızı) aksine beyaz baktım. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama çekirdeği varlığı sadece normal ama decellularized damarlar gösterdi. Recellularized şekilde, H & E boyama ven luminal yüzeyinde hücreleri varlığını gösterdi.

Normal bir damar brüt morfolojisi ışıktır kırmızı (Şekil 3A). Kırmızı renk ilerici decellularization döngülerle kaybolur (döngüsü 2, Şekil 3B; 3, döngüsü Şekil 3 c) ve 5th döngüsü tarafından görünüyor soluk ve beyaz (şekil 3D). Recellularized damar kan perfüzyon (Şekil 3E) ve endotel medya perfüzyon (Şekil 3F) sonra parlak kırmızı renkte görünüyor. (Şekil 4B) H & E boyama içinde yok Mavi çekirdeği görüldüğü decellularization tedavi 5 döngüleri damar hücreleri başarıyla kaldırıldı. Buna ek olarak, birkaç çekirdek normal şekilde (Şekil 4A) görüldü. Luminal tarafındaki ekli hücrelerin varlığı recellularized ven kan 48 h (Şekil 4 c, siyah ok) ve sonra 96 h (şekil 3D, siyah oklar) endotel orta ile perfüzyon ile H & E boyama içinde görülür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Resim 1 : Perfüzyon kurulumları için decellularization montajı. A) birleştirilmiş decellularization kurulumu 1 Triton X-100 için gösteren ve yıkama resim. Beyaz ok çözümleri için akış yolu gösterme ve kırmızı oklar giriş ve çıkışları ven ve çözümler için gösterir. B) TnBP perfüzyon monte decellularization kurulum 2 gösteren resim. Benzer şekilde, decellularization Kur 1, olduğu gibi beyaz ok çözümleri için akış yolunu göstermek ve kırmızı oklar giriş ve çıkışları ven ve çözümler için gösterir. C) deoksiribonükleaz perfüzyon monte decellularization Kur 3 gösteren resim. Beyaz ok çözümleri için akış yolu gösterme ve kırmızı oklar alıcılar ven ve çözümler için gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Resim 2 : Hazırlık ve recellularization için biyoreaktör montajı. A) resim gösteren malzemeler biyoreaktör montajı için gerekli. B) bağlayıcılar (kırmızı oklar), azaltmak amacıyla yerleşim gösteren 4-port kap içine resmini puan damar giriş ve çıkış (beyaz ok) ve düzeni tüpler H, ben ve J. bağlanmak için Ücretsiz Tüp H sonuna medya dönmek için biyoreaktör yerleştirilir. C) ve dışarı gidiyor ilgili tüpler 4 bağlantı noktası kap üst taraftan görülebilir. D) monte biyoreaktör gösteren resim. E) bütün biyoreaktör Kur peristaltik pompa ile gösteren resim. Tüpler K biyoreaktör bağlantılarından peristaltik pompa uzatın. F) bütün biyoreaktör perfüzyon sistemi şematik gösterimi. Turuncu oklar, akış yönünü gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Şekil 3 : Decellularization ve recellularization sırasında damarlar morfolojisi brüt. A) normal damar brüt morfolojisi parlak kırmızı renkte görünüyor. Rengi decellularization devir sayısının artması ile kaybolur B) 2 döngüsü ve C) 3 döngüsü. D) 5 tarafından devir, damar görünüyor soluk ve beyaz. E ile ventriküler sonra ven) kan 48 h ve F) endotel ortamı için 96 h ile bir kez daha parlak kırmızı renkte görünüyor. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Şekil 4 : Decellularized ve recellularized damarlar karakterizasyonu. Hematoksilen ve görüntü boyama eozin A) normal damar içeren birçok mavi çekirdeği ama yok bunlar içinde B) decellularized damar. İle recellularized ven C) kan ile ve 48 h için D) 96 h, ek hücre (siyah oklar) lümen, endotel orta olduğunu fark ettim. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins at JoVE.com

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization ve Recellularization metodoloji insan safen damarlar için

Burada, deterjanlar ve recellularization tarafından periferik kan ve endotel orta perfüzyon kullanarak safen ven decellularization için bir protokol açıklayın.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K Görüntüleme.  University of Gothenburg. Burada, deterjanlar ve recellularization tarafından periferik kan ve endotel orta perfüzyon kullanarak safen ven decellularization için bir protokol açıklayın.

Video: Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Biyomühendislik

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Doku Değerlendirilmesinde Manyetik Rezonans Elastography Metodoloji Construct Büyüme Tasarlandı

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

Doğal Aselüler Bağırsak Matrix&#39;in üretimi için bir Decellularization Metodoloji

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Bir Salınım basınçlı perfüzyon Aygıt Sıçan karaciğerinin decellularization Prosedürü

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Biomimetic kimyasal Neuromodulation, sıçan retina nörotransmitter Glutamat Vitro ile için metodoloji

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

Vitro çalışmalar için 3D benzeri platformlar olarak Fetal ve yetişkin kalp doku karşılaştırılabilir Decellularization Explants

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...