R.J.M. es apoyado por una beca de doctorado de AMC. Esta investigación fue apoyada por la sociedad holandesa del cáncer (subvención a KWF UVA 2014-6839). Los autores agradecen a Dr. A. Jonker por su ayuda con la redacción del protocolo.

Este protocolo sigue las pautas sobre el uso de material humano de la Junta de revisión de ética médica del centro médico académico.
1. preparación de células o de tejido
<ol><li>Células<ol>
<li>Trypsinize las células de los platos de la cultura usando 1 mL de tripsina-EDTA 0.25% por 5 min a 37 ° C en una placa de Petri de 10 mm y traer las células en una suspensión de 37 ° C de 50.000-200.000 células/mL, dependiendo del tamaño de las células.</li>
		<li>Colocar 200 μL de la suspensión de células en portaobjetos de microscopía en embudos de cytospin Citocentrifuga 20 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deje secar al aire los cytospins durante 24 h a temperatura ambiente. Esto no afecta la actividad de la deshidrogenasa. 5
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Secciones de tejido<ol>
<li>Extraer tejido de pacientes o animales según permisos de éticas. 10 mm3 de tejido es suficiente para experimentos múltiples.</li>
		<li>Poner las piezas de tejido en frascos plásticos pequeños ventilado 2 mL y snap-congelar los frascos con el trozo de tejido en nitrógeno líquido.</li>
		<li>Almacenar los frascos que contienen piezas de tejido en el ° C −80 hasta la transformación posterior.</li>
		<li>Utilice un medio gelatinoso que se denomina temperatura de corte óptima (OCT) para montar la muestra de tejido en un mandril que se congela hasta-20 ° C a-25 ° C rápidamente, para que el agua no puede formar cristales.</li>
		<li>Uso de un criostato para corte y primero recortar el bloque hasta el nivel deseado (idealmente la mitad del ancho de un microscopio de vidrio diapositiva, por ejemplo 5 x 5 mm).</li>
		<li>Al seccionamiento, usar cepillos y una placa estabilizadora para impedir que las secciones que se encrespa hacia arriba.</li>
		<li>Cortar muestras de tejido en secciones de 6-10 μm de grosor a una velocidad lenta pero constante (1 s por sección). Cuando una sección se corta correctamente, queda plano sobre la cuchilla de micrótomo debajo de la placa estabilizadora.</li>
		<li>Levante 1-3 secciones en un portaobjetos microscópico y almacenar a −80 ° C hasta su uso. El número de cortes depende del tamaño de la muestra de tejido y el grosor deseado de las secciones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enzima Histo/citoquímica de Deshidrogenasas solubles
<ol><li>Preparación de Buffer de reacción.<ol>
<li>Preparar 100 mL de tampón fosfato de pH correcta (ver tabla 1; cada enzima tiene un pH óptimo en el cual su actividad es el más alto). Por ejemplo, mezclar soluciones de 0,1 M KH2PO4 (ácido) y 0.1 M NA2HPO4 (básico) hasta un tampón con el pH correcto.</li>
		<li>Pesar 18 g de alcohol de polivinilo (PVA) en el tampón fosfato bajo una campana de humos como el PVA es polvo y tóxicos.<ol>
<li>El 18% w/v PVA en el tampón de fosfato a 100 ° C se disuelven calentando la solución au bain marie (poner la botella de cristal en agua hirviendo) y revolviendo hasta que el PVA se haya disuelto completamente. La solución será entonces, transparente, con pequeñas burbujas de aire que son causadas por la agitación. Por lo general requiere ~ 15 min para el PVA disolver. Nota: El 18% w/v PVA en tampón fosfato es viscoso y puede ser transferido a tubos de tampón de reacción de 15 mL con una pipeta de amplia. Almacenamiento a corto plazo 18% w/v PVA en tampón fosfato debe ocurrir a ≥ 40 ° C y almacenamiento a largo plazo (hasta 2 semanas) a ≥ 60 ° C. 250 μl de 18% w/v PVA en tampón fosfato es típicamente necesario para una preparación de cytospin, mientras que 500 μl se requiere para una sección de tejido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar solución de tetrazolio sal (nitroBT). Por cada 1 mL de medio de incubación, 40 μl de solución de nitroBT es necesario, que consta de 5 mg de nitroBT (un polvo amarillo) disuelto en una mezcla de 20 μl dimetilformamida (DMF) y 20 μl de etanol, que será una solución transparente amarillo clara. Nota: Debido a la estabilidad del nitroBT es el más bajo de todos los reactivos necesarios, se recomienda preparar la solución nitroBT último y disolver primero la nitroBT en el medio de reacción.<ol>
<li>Disolver nitroBT en DMF y etanol calentando en un frasco de vidrio durante un corto período de tiempo (~ 10 s) utilizando un mechero Bunsen. Agitar el frasco durante el calentamiento y no deje el frasco mucho tiempo en la llama para evitar la evaporación.</li>
			<li>Hacer 10% solución nitroBT extra para permitir la evaporación del DMF y etanol durante el proceso de disolución.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Escudo de los electrones portadores phenazine methosulfate (PMS) o (1-metoxi)-phenazine methosulfate (mPMS) e incubación los medios de comunicación que contiene m(PMS) de luz directa envolviendo papel de aluminio alrededor de la cubeta de almacenamiento de vidrio.</li>
		<li>Preparar soluciones de reactivos según la tabla 1 mediante la disolución en agua destilada H2O. Algunos reactivos perecen rápidamente, para prepararlos como poco antes de la experiencia posible. No soluciones reactivo en hielo o a 4 ° C hasta su uso.</li>
		<li>Preparar medios de incubación como se muestra en la tabla 1 y homogeneizar la solución después de cada paso por agitación suave. Removiendo continuamente y mantener la espátula debajo de la superficie del medio de incubación removiendo para evitar la generación de burbujas de aire en el medio de incubación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicación del medio de incubación para las secciones de tejido<ol>
<li>Microscopía de pre-warm diapositivas con cytospins o secciones de tejido Unidas a 37 ° C en una cámara de incubación immunohistochemistry para 15 minutos sumergen la parte inferior de la cámara de incubación de la inmunohistoquímica con agua tibia para mantener una temperatura constante en el incubadora.</li>
		<li>Con cuidado romper o sierra de Pipetas Pasteur en la transición desde el estrecho a la parte ancha. Pipetas Pasteur regulares son demasiado angostas para aspirar el medio de incubación viscoso, así que este paso es necesario para hacer Pasteur pipetas suficientemente amplio como para la aspiración del medio de incubación.</li>
		<li>Aplicar 250-500 μl del medio de incubación adecuados a cada preparación de la célula o tejido sección en portaobjetos de microscopía con la parte ancha de una pipeta Pasteur.</li>
		<li>Utilice la punta de pipeta para estirar uniformemente el medio de incubación. No pequeñas burbujas de aire en el medio de incubación, porque estos flotarán a la superficie y no interferirá con la reacción enzimática en la sección de preparación o tejido de células sobre el portaobjetos de microscopía.</li>
		<li>Incubar las secciones de tejido sobre el portaobjetos de microscopía en una incubadora de 37 ° C (por ejemplo, una incubadora de cultivo de tejidos) o preparaciones celulares para una duración previamente especificada, dependiendo de la cinética de la enzima y su expresión en una preparación particular de la célula o tejido (tabla 1). Mantenga la tapa de la cámara de incubación immunohistochemistry cerrada para mantener un ambiente húmedo para evitar el buffer de reacción de la desecación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar los portaobjetos de microscopía<ol>
<li>Tap off medio de incubación excesiva de un tejido.</li>
		<li>Mecánicamente aclara el medio de incubación de los portaobjetos de microscopía en 60 ° C de tampón fosfato, pH 5.3, moviendo arriba y abajo los portaobjetos de microscopía en el búfer. Esto detiene la reacción enzimática.</li>
		<li>Lave los portaobjetos de microscopía por mantenerlos en 60 ° C de tampón fosfato, pH 5.3 por 20 min.</li>
		<li>Mecánicamente, lave los portaobjetos de microscopía en agua de 60 ° C.</li>
		<li>Lave los portaobjetos de microscopía por mantenerlos en agua de 60 ° C por 20 min.</li>
		<li>Deje que el agua y toboganes enfríen mezclando lentamente temperatura agua del grifo con agua del grifo de 60 ° C durante 1 minuto.</li>
		<li>Realizar un lavado mecánico final paso en agua a temperatura ambiente agua destilada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adjuntar los Cytospins manchada o secciones de tejido en portaobjetos de microscopía<ol>
<li>Caliente previamente una diapositiva más caliente a 50-60 ° C.</li>
		<li>Cuidadosamente la parte posterior de los portaobjetos de microscopía utilizando una toalla de papel en seco y coloque en la diapositiva calentador para secar la parte superior de la diapositiva del microscopio.</li>
		<li>Cuando estén secas las diapositivas, incluir preparaciones celulares o secciones de tejido en portaobjetos de microscopía con cubreobjetos y medio de montaje de jalea de glicerol.</li>
		<li>Guardar las preparaciones celulares o portaobjetos de microscopía de secciones de tejido en la oscuridad en un refrigerador a 4 ° C o proceder inmediatamente con la adquisición de la imagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. adquisición de la imagen
<ol><li>Grabar imágenes con una cámara de CCD monocroma científica con suficiente rango dinámico (por lo menos 8 bits pero preferiblemente 10 bits o 12 bits), fijadas de ganancia y una respuesta lineal.</li>
	<li>Seleccione un objetivo apropiado (20 X X-63 de cytospins) y 10-63 X para las secciones de tejido.</li>
	<li>Reducir el resplandor reduciendo el diafragma de campo para que sea ligeramente más grande que el campo de visión.</li>
	<li>Uso de luz monocromática mediante la aplicación de un filtro de inferencia de amplia banda nm 10 cerca de la longitud de onda de isobestic de precipitado precipitado7 en combinación con un infrarrojo de bloqueo del filtro (véase Tabla de materiales). Nota: La absorbancia máxima isobestic de nitroBT es a 585 nm.</li>
	<li>Optimizar la iluminación para asegurar que se utiliza toda la gama nivel gris de la cámara (es decir, establecer el nivel de iluminación iluminación máxima es lograr sin exponer demasiado al grabar un portaobjetos de microscopio en blanco).</li>
	<li>Calibrar los valores medidos los niveles de grises a absorbancia conocida (o densidad óptica [OD]). Para ello, captura imágenes en escala de grises de al menos 10 diferentes pasos de una diapositiva de calibración o tableta con valores conocidos de OD (ver paso 4.1.1), ya sea comercialmente disponible (ver la Tabla de materiales) o medir una tableta de paso cuña de grises por encargo por un densitophotometer y usar los resultados para calibrar medidos gris valores de absorbancia conocida.</li>
	<li>Captura de fotomicrografías de células o secciones de tejido de interés.</li>
</ol>4. Análisis de la imagen
<ol><li>Antes del análisis de imagen, calibrar el software ImageJ para medidas de absorbancia.<ol>
<li>Medir la absorbancia (OD) de fotomicrografías de al menos 10 áreas de calibración con parámetros absorbancia conocida en la tableta de diapositiva o paso de calibración con valores conocidos de OD. En ImageJ, utilice el menú de analizar → medida o combinación de teclas Ctrl + M para medir un área seleccionada.</li>
		<li>Iniciar el procedimiento de calibración de absorbancia por ir a Analyze → calibración. Seleccione la función "Rodbard (NIH Image)". En la columna izquierda de la ventana que se abre, ya están presentes los resultados de mediciones de nivel gris de cada paso de la tableta de diapositiva/paso de calibración realizado en 4.1.1. Si no, copiar desde la pantalla de resultados de ImageJ. En la columna derecha, escriba cada valor correspondiente de absorbancia conocida como impreso en el certificado que recibió con la tableta de paso calibradas. Marque las casillas "calibración Global" y "Mostrar terreno" y pulse "OK".</li>
		<li>Control de calidad, asegúrese de que el R2 de la función de Rodbard > 0,99. Si es < 0.99, compruebe si las diapositivas de calibración fueron fotografiadas y medidas correctamente y si los parámetros absorbancia conocida fueron ingresados correctamente.</li>
		<li>ImageJ está ahora calibrado hasta que cierre el programa (por lo tanto "Calibración Global"). Para las mediciones de absorbancia, una sesión de ImageJ calibrada siempre convierte que la absorbancia observada significa valores entre 0 y 1, donde 0 y 1 son asíntotas de cero y completa absorción, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cytospins, seleccione > 100 células de forma aleatoria. Para las secciones de tejido, seleccione uno o más campos de interés de una longitud fija y anchura en todas las secciones.<ol>
<li>Proyecto de una trama sobre microfotografías para ayudar en la selección imparcial de la célula. En ImageJ, proyecto una cuadrícula sobre una imagen a través del menú de Plugins → analizar → red.</li>
		<li>En ImageJ, utilice la herramienta elíptica para seleccionar celdas individuales y utilice la herramienta Rectángulo para seleccionar regiones de tejido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir la absorbancia y el área de las celdas seleccionadas o regiones de tejido. La densidad óptica y la zona se llaman "Significa" y "Zona" en el ImageJ resultados de hoja de cálculo, respectivamente. Nota: La absorbancia total de una región tisular o celular (si ha seleccionado varias regiones de tejido de diferentes tamaños) es igual a la suma de todos absorbancia píxeles separados. Si una célula es reflejada por 1000 píxeles, entonces la absorbancia total está dada por la suma de 1000 absorbancia y la absorbancia media está dada por la absorbancia total/1000. Este procedimiento también evita errores de distribución.</li>
	<li>Determinar la absorbancia total media de > 30 células o regiones de tejido de las diapositivas del control, que contiene una muestra que se expuso para controlar el medio de incubación en la ausencia de sustrato, pero en presencia de cofactores. Esta absorbancia de control es control para tinción de actividad de enzima inespecífica y artefactos de absorción inducida por las diapositivas usadas microscopia, montaje medio, cubreobjetos o microscopio.</li>
	<li>Restar la absorbancia del medio del control de todas las medidas de absorbancia total de muestras que fueron expuestas al medio de incubación con la misma concentración de cofactor (pero diferentes concentraciones de sustrato o inhibidor). De este modo la absorbancia corregida total de una región de la célula o tejido.</li>
	<li>Comparar estadísticamente las absorbancias promedio de total corregidas utilizando la prueba T o prueba ANOVA unidireccional, dependiendo de su diseño experimental.</li>
	<li>Absorbencia del precipitado se puede convertir en actividad de enzima (sustrato μmol convertido por mL por min) utilizando la ley de Lambert-Beer: c=A/(є×d), donde c es la concentración del precipitado en el medio de reacción, A es la absorbancia medida en ImageJ después de la calibración; Є es el coeficiente de extinción de formazán (16.000, a 585 nm)8 y d es la luz que viaja a distancia, que es igual a la célula promedio grueso o espesor de corte de sección nominal (6-10 μm en este protocolo). Nota: Después de secar, el espesor de la sección de tejido disminuye 50% el espesor de corte nominal de la sección, pero esto no se refleja en el cálculo por encima porque el espesor de corte nominal de la sección es biológicamente más relevantes. La célula promedio espesor y dimensiones de la esfera de preparates adherido al portaobjetos de microscopía celular pueden ser determinados mediante microscopía confocal o microscopía de amplio campo, para que los protocolos se pueden encontrar en otros lugares. 9 , 10
</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Investigación sobre el metabolismo celular está experimentando actualmente un renacimiento porque los investigadores se dan cuenta ahora que los efectos metabólicos son cruciales para la patogenesia y el tratamiento de muchas enfermedades. 1 además, investigación metabólica es ayudado por una mayor disponibilidad de técnicas que proporcionan este campo de investigación con más herramientas que nunca, incluyendo espectrometría de masas, etiquetado radioisotópica y espectrometría de resonancia magnética nuclear. Mapeo metabólico no es una técnica nueva, pero su capacidad para dar información integrada en la actividad de las enzimas en una situación casi verdadero a la naturaleza hace esta técnica más relevante que nunca. 2
Los cofactores NAD+ y NADP+ se encuentran en todas las células vivas, que indica que Deshidrogenasas se presentaron muy temprano durante la evolución y tienen un papel clave en el metabolismo celular. 14 , 15 existen 523 reacciones enzima-catalizadas que se clasifican como Deshidrogenasas y ocurren a través de todas las especies. 16 en teoría, la actividad de todas las reacciones de diferentes deshidrogenasa puede ser por separado investigada afinando el protocolo mapeo metabólico descrito aquí. Cada reacción enzimática es el único mediante el sustrato y cofactores necesarios para su actividad. Por lo tanto, la actividad de cada reacción enzimática puede ser determinada mediante un experimento de mapeo metabólico con el adecuado sustrato y cofactores en el medio de reacción. Sin embargo, algunas isoformas de la enzima difieren en su localización subcelular, por ejemplo, una isoforma cataliza una reacción en el citoplasma mientras que la otra isoforma funciona en la mitocondria. Un ejemplo notable es IDH1 y IDH2, de los cuales el primero es citoplásmico y mitocondrial es el último y que son dos diferentes proteínas codificadas por dos genes diferentes. 11 methylsulfate de 1-metoxi-5-methylphenazinium (metoxi-PMS) y 5-methylphenazinium methylsulfate (SPM) pueden tanto utilizar como portadores de electrones para estos experimentos. El primero no pasa las membranas mitocondriales, el último no. Por lo tanto, las investigaciones sobre las enzimas mitocondriales (e.g. IDH2) deben usar PMS Considerando que las investigaciones sobre las enzimas citosólicas (e.g. IDH1) deben utilizar mPMS.
Como con muchas técnicas, variaciones de este protocolo, como el uso de diferentes tipos de sales de tetrazolio, excepto la adición de PMS y la azida de sodio, utilizando un medio de montaje acuoso y variando la incubación y lavado veces, y pueden funcionar igualmente bien. La aplicación de mapeo metabólico con sales de tetrazolio no se limita a Deshidrogenasas. Con pequeñas modificaciones en el protocolo, también puede ser utilizado para la evaluación de la actividad de enzimas que funcionan directamente aguas arriba de una deshidrogenasa en una vía metabólica. Anteriormente hemos descrito este principio para la enzima glutaminasa,17 que funciona directamente aguas arriba de la glutamato deshidrogenasa de la vía glutaminolysis. 18 en teoría, el mismo principio puede aplicarse a otras enzimas eso ciclo de la función directamente aguas abajo o aguas arriba de una deshidrogenasa por ejemplo aconitase, que se encuentra directamente arriba del IDH2 y IDH3 en el ácido tricarboxílico (TCA). Otra simple variación de las concentraciones descritas en la tabla 1 es por medio de hacer frascos medio incubación con diferentes concentraciones de sustrato, cofactor o inhibidor. Esto permite la generación de curvas de actividad de la dosis en función de la concentración de sustrato, cofactor o inhibición.
Técnicamente hablando, metabólicas experimentos de mapeo no facilitan observaciones imparciales de en situ la actividad enzimática, ya que los investigadores tienen que elegir una concentración de sustrato y cofactor que puede no reflejar los niveles de sustrato y cofactor están presentes en situ. Además, el uso de la viscosa 18% PVA en el medio de reacción sirve para mantener intacta, macromoléculas y en conformación, pero prohíbe la difusión eficaz de bajo peso molecular reactivos a través del medio de reacción. 3 , 5 por lo tanto, las actividades de determinada enzima en los experimentos descritos aquí que las concentraciones de sustrato supraphysiological no reflejan la situación en vivo a una concentración de sustrato determinada pero son adecuados para comparaciones de la experimentales. Así, el resultado de los experimentos de mapeo metabólico es la capacidad de producción (máxima actividad) de una reacción enzimática en el contexto de los niveles de sustrato y cofactor que está presente in situ. Por otra parte, el uso de múltiples muestras y varias concentraciones de sustrato y cofactores permite comparación imparcial de la capacidad de producción máxima (Vmax) y la afinidad (Km) de una enzima por un sustrato/cofactor en preparaciones celulares , tejidos o regiones de tejido. Estos parámetros son el resultado de la suma de la expresión de la proteína enzimática, modificaciones poste-de translación y el efecto de un microambiente concurrido en la actividad de las enzimas. Por lo tanto, mapeo metabólico es todavía un mejor reflejo de la actividad enzimática que experimentos que determinan la expresión de la proteína o purificado enzimático actividad en vitro.

Un pilar esencial de la fisiología celular es el metabolismo. Metabolismo proporciona la energía necesaria para todos los procesos fisiológicos de las células, proporciona los bloques de edificio para biosíntesis macromolecular y regula la homeostasis celular con respecto a los productos de desecho, moléculas tóxicas y el desmontaje y reciclaje de componentes celulares innecesarios o disfuncionales. Las enzimas catalizan las reacciones químicas celulares vitales casi todos y por lo tanto las unidades motoras en la fisiología de las células. 1 , 2
La actividad de las enzimas es regulada firmemente en muchos niveles y por lo tanto la enzima cuantitativa histoquímica y citoquímica (también llamada mapeo metabólico) es el método preferido para el estudio de actividad enzimática in situ. A nivel transcripcional, la expresión del gen en ARNm está regulada. El efecto de la regulación de la transcripción puede ser determinado mediante ensayos de mRNA cuantitativos, tales como microarrays o secuencia de RNA directa o cualitativa análisis de mRNA, como la hibridación in situ que da la información en el celular (secundario) localización de las moléculas de mRNA. Esto permite apreciar las diferencias relativas en la actividad transcripcional entre las células. Sin embargo, la interpretación y validez de estos análisis de mRNA con respecto a la actividad metabólica es complicado porque la regulación se produce también a nivel de mRNA, en secuencia y la estabilidad de las moléculas de mRNA son editados después se transcribe de la DNA. Esta edición regula la traducción de la isoforma de la proteína y la cantidad de traducción de proteínas en los ribosomas. Además, el proceso de traducción de proteínas está controlado y en última instancia afecta la actividad y por lo tanto la expresión de la enzima. Los efectos combinados de los pasos reglamentarios mencionados pueden apreciarse mediante ensayos de expresión cuantitativa de la proteína, como el Western Blotting o microarrays lisado de proteínas de fase inversa o ensayos de expresión cualitativa de la proteína, tales como immunocytochemistry y la inmunohistoquímica, pero estas técnicas no incorporar efectos de regulación aguas abajo como modificación post-translacional de las proteínas y la regulación funcional de las enzimas en su microambiente llena de gente. Por otra parte, la expresión de una enzima mal puede correlacionar con su actividad, por lo que las mediciones de actividad de una enzima purificada en homogenados de tejido o célula o en soluciones diluidas son ampliamente utilizadas para estudios de actividad de la enzima. Sin embargo, estos experimentos no replicar la influencia de un citoplasma compartimentado atestado o un organelo en la actividad de una enzima. Además, todas las técnicas mencionadas determinan la cantidad o la localización de la expresión de mRNA o de la enzima, pero son incapaces de dar la información completa en ambos de estos aspectos de expresión de la enzima, por no hablar de la integración de este información con las determinaciones de actividad enzimática. 2 , 3 , 4
Asignación de metabólica permite la apreciación de todas las variables mencionadas que determinan la actividad de una enzima. Es más, mapeo metabólico es una forma de vida celular o tisular con células y tejidos que se mantienen intactos durante el análisis para generar una situación de casi verdadero a la naturaleza para generar datos de actividad de las enzimas. Produce imágenes que facilitan tanto la apreciación detallada de la ubicación de la actividad enzimática así como robusta cuantificación de la actividad enzimática dentro de un compartimiento de la célula o tejido. 3 , 4 los protocolos descritos aquí para mapas metabólicos de la actividad de Deshidrogenasas se basan en el manual de laboratorio de todos los métodos histoquímicos de enzima disponible, en los principios de histoquímica de la enzima cuantitativos,6 y5 Análisis de imagen de mapeo metabólico cuantitativa. 4
Deshidrogenasas son enzimas que llevan a cabo las reacciones redox para reducir canónicos cofactores tales como NAD++ de NADP y FAD a NADH, NADPH y FADH2, respectivamente. Las células intactas o secciones de tejido de criostato que químicamente no son fijos se incuban en un medio de reacción que contiene, entre otros reactivos, el sustrato y cofactores de una deshidrogenasa específica y una sal de tetrazolio. Posteriormente, eso dehydrogenase realiza su actividad catalítica y reduce, por ejemplo,+ de NADP a NADPH. Través de un portador de electrones, 2 moléculas de NADPH reducen 1 molécula de sal de tetrazolio incoloro y soluble en agua en la molécula 1 formazán azul de insoluble en agua que se precipita inmediatamente en el sitio de la deshidrogenasa. Por lo tanto, la absorbencia del precipitado precipitado es una medida directa de la actividad local de una deshidrogenasa y puede ser observada mediante microscopía o cuantificada mediante el análisis de microscopía e imagen luz monocromático. El aspecto cuantitativo de este protocolo permite a los investigadores extraer conclusiones estadísticas de estos ensayos. Además, esta cuantificación facilita la determinación de en situ parámetros cinéticos de la enzima como la actividad enzimática máxima (Vmax) y la afinidad de un sustrato para una enzima (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Al planear un experimento de mapeo metabólico, es importante tener en cuenta que por experimento, se recomienda un máximo de 50 portaobjetos con preparados de células adherentes o secciones de tejido para minimizar retrasos durante la incubación para obtener constantes resultados. Es posible procesar más diapositivas o composiciones medio cuando estos pasos del Protocolo se llevan a cabo conjuntamente por más de un experimentador. Además, existe una cierta variabilidad entre experimentos. Por lo tanto, idénticos experimentos deben repetirse al menos 3 veces con cytospins de cada preparación de células o secciones de cada muestra de tejido y los controles adecuados deben incluirse en cada experimento. Siempre preparar un medio de incubación control en ausencia de sustrato, pero en presencia de cofactores a control para la tinción de actividad de enzimas no específicas. Los resultados más representativos se obtienen en experimentos donde las concentraciones de sustrato/cofactor diferentes se aplican a secciones de tejidos o preparaciones celulares de la misma muestra, para que el experimentador pueda realizar los análisis de enzima cinética utilizando curvas de dosis-actividad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2754</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Glucose 6-phosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">106559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium succinate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I1252&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Malic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Glycerol Gelatin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Lithium 6-phospho-D-galactonate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">55962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">methoxy-Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28966.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0505&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NADP-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">32030.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium L-lactate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:343px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Grey-step wedge</td>
			<td style="width:343px;">Stouffer Industries</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.stouffer.net/TransPage.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues

Metabolismo celular alterado es una de muchas enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedades cardiovasculares y la infección. Las unidades motoras metabólicas de las células son las enzimas y su actividad es regulada pesadamente en muchos niveles, incluyendo el transcripcional, estabilidad del mRNA, nivel traduccional, poste-de translación y funcional. Presente Reglamento complejo significa que ensayos cuantitativos o proyección de imagen convencionales, como cuantitativa mRNA experimentos, Western Blots e inmunohistoquímica, dan información incompleta con respecto a la última actividad de las enzimas, su función o su localización subcelular. Citoquímica enzimática cuantitativa e histoquímica (es decir, mapeo metabólico) muestran información detallada sobre en situ la actividad enzimática y su cinética, función y localización subcelular en una situación casi verdadero a la naturaleza.
Se describe un protocolo para detectar la actividad de Deshidrogenasas, que son las enzimas que llevan a cabo las reacciones redox para reducir cofactores FAD como quinona+ . Secciones de tejido y las células se incuban en un medio que es específico para la actividad enzimática de una deshidrogenasa. Posteriormente, la deshidrogenasa que es objeto de investigación realiza su actividad enzimática en su sitio subcelular. En una reacción química con el medio de reacción, esto en última instancia genera precipitado de color azul en el sitio de la actividad de la deshidrogenasa. La absorbancia de formazán por lo tanto es una medida directa de la actividad de la deshidrogenasa y puede ser cuantificada mediante el análisis de microscopía e imagen luz monocromático. El aspecto cuantitativo de este protocolo permite a los investigadores extraer conclusiones estadísticas de estos ensayos.
Además de los estudios observacionales, esta técnica puede utilizarse para estudios de inhibición de enzimas específicas. En este contexto, los estudios se benefician de las ventajas de la verdadero-a-naturaleza de mapeo metabólico, dando en situ los resultados que puede ser fisiológicamente más relevante que en vitro estudios de inhibición de la enzima. En total, mapeo metabólico es una técnica indispensable para el estudio de metabolismo a nivel celular o tejido. La técnica es fácil de adoptar, proporciona información metabólica profunda, integral e integrada y permite un análisis cuantitativo rápido.

Se muestran varios protocolos para preparar el medio de incubación para investigar la actividad de una deshidrogenasa particular. Para cada deshidrogenasa, disolver los reactivos enumerados en la solución PVA manteniendo una temperatura de menos de 37 ° C. Deben disolver los reactivos en el orden indicado en la tabla, es decir, nitroBT siempre se disuelve primero y (m) PMS se disuelve siempre última. Cada 5 mg de nitroBT se disuelve en 40 μl mezclar (20 μl etanol + 20 μl dimetilformamida). Todos los volúmenes están por 1 mL de solución PVA 18%, que se puede utilizar para manchar ~ 2 secciones de tejidos o preparaciones de ~ 4 celulares en portaobjetos de vidrio. NitroBT, NAD+, NADP+, soluciones ADP y sustrato deben hacerse recién. NaN3, MgCl2 y (m) PMS soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante un mes. 18% PVA disuelto en fosfato buffer puede almacenarse a 60 ° C durante 2 semanas. El pH de la solución PVA 18% puede configurarse con diferentes composiciones de dihidrógenofosfato de potasio de 0,1 M (KH2PO4) los búferes de 0.1 M disodio hidrógeno fosfato (NA2HPO4). Los períodos de incubación indicado proporcionan buenos puntos de partida, pero los períodos de incubación óptima dependen de la especie, el tipo de tejido y la preservación del tejido. En general, preparaciones celulares deben ser incubadas ya que las secciones de tejido para obtener un nivel similar de la producción de formazán.
Tipo salvaje Isocitrato deshidrogenasa 1 y 2 (IDH1/2) catalizan la conversión del isocitrato en α-cetoglutarato (αKG) con reducción concomitante de la+ de NADP a NADPH en el citoplasma y las mitocondrias, respectivamente. Estas enzimas han despertado recientemente interés porque IDH1/2 mutaciones ocurren en varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer primario del cerebro (glioblastoma) y el cáncer colorrectal y ofrecen una oportunidad única para demostrar las posibilidades de Mapeo metabólico. Mutaciones de IDH1 desactivar la actividad de la enzima de tipo salvaje de IDH1 y también inducir una actividad neo-enzimático que conduce a la producción y la acumulación subsiguiente de la oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 que es discutido en otras partes en detalle. 12 mapeo metabólicas experimentos demostraron eso NADP+-dependiente IDH1/2 actividad fue significativamente menor en las células del carcinoma colorrectal con una golpeado en IDH1 mutación heterozigótica que en células de carcinoma colorrectal que fueron IDH1 tipo salvaje (figura 1A). Esta diferencia se cuantificó por análisis de imagen de microfotografías de luz monocromáticas (figura 1B). 12
Otro ejemplo ilustrativo de los experimentos de mapeo metabólico se muestra en la figura 2, que es una imagen de una sección de criostato de cerebro de ratón que fueron inyectado con células de glioblastoma humano. IDH1/2 es el más importante proveedor de NADPH en cerebro humano y su actividad es upregulated en glioblastoma de IDH1/2 de tipo salvaje, mientras que la capacidad de producción de NADPH de IDH1/2 es mucho menor en los cerebros de los roedores. 11 Figura 2A muestra la diferencia entre la alta NADP+-dependiente IDH1/2 actividad en células de glioblastoma humano y el NADP baja+-dependiente IDH1/2 actividad en cerebro de ratón sano. Actividad de IDH1/2 se cuantifica como la producción de NADPH μmol / mL de tejido por minuto en la figura 2B.
La reacción enzimática de IDH1/2 es relativamente sencilla, pero el lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima más complicada complejo. LDH convierte la conversión reversible de lactato a piruvato con la concomitante reducción de NAD+ a NADH o viceversa. La disponibilidad de lactato y piruvato y la composición de la enzima LDH complejo dicta si lactato es sobre todo convertirse en piruvato (que es catalizada por la LDH-B y produce NADH) o si piruvato se convierte principalmente para el lactato (que es catalizada por la LDH-A y consume NADH). Experimentos de mapeo metabólico 13 son capaces de visualizar la actividad de la reacción de la LDH-B, pero son "ciegos" a la actividad de la reacción de la LDH-A porque no ocurre producción de NADH y como consecuencia de ello nitroBT no se reduce a formazán. La figura 3 muestra el NAD+-dependiente de actividad LDH (es decir, la conversión de lactato a piruvato) en cerebro humano secciones en ausencia de sustrato (Figura 3A), en presencia de una alta concentración de lactato (figura 3B ), en presencia de lactato 6 mM (figura 3) y en presencia de una baja concentración de lactato y una concentración superior de piruvato (figura 3D). Los resultados de estos experimentos ilustran metabólica mapeo adecuadamente capta que el NAD+-dependiente de actividad de la LDH en secciones del tejido depende de la disponibilidad de lactato y piruvato en el medio de reacción.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig1.jpg">
Figura 1 . +De NADP-dependiente IDH1/2 actividad de las células del carcinoma colorrectal humano. (A) representante monocromático luz fotomicrografías de células de carcinoma colorrectal humano HCT116 después de la tinción para el NADP+-actividad dependiente de IDH1/2 contra 1-10 mM isocitrato y 0,8 mM NADP+. Barras de escala = 50 μm. (B) cuantificación de la absorbancia del formazán azul producida a partir de nitroBT por NADP+-actividad dependiente de IDH1/2 por la célula aparece con el uso de luz monocromática en (A) y análisis de imagen. Siglas: IDH1WT/WT, Isocitrato deshidrogenasa 1 tipo salvaje; IDH1WT/MUT, Isocitrato deshidrogenasa 1 mutado. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56843/56843fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig2.jpg">
Figura 2 . +De NADP-dependiente IDH1/2 actividad de las muestras de glioblastoma humano. (A) representante microfotografía de una sección del cerebro del ratón que contiene el cerebro de ratón sano (h) y un xenoinjerto tumoral de glioblastoma humano (t) después de la tinción para el NADP+-dependiente IDH1/2 actividad en presencia de 0.8 NADP+ de mM y 2 mM isocitrato. Barra de escala = 200 μm (B) cuantificación de actividad de enzima de áreas del cerebro de ratón (h) y xenoinjerto de glioblastoma humano (t) se muestra en (A) utilizando la ley de Lambert-Beer. Barras de error representan desviaciones estándar. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56843/56843fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig3.jpg">
Figura 3 . +De NAD-dependiente lactato deshidrogenasa (LDH) actividad de muestras de cerebro humano. Microfotografías representativas de secciones seriadas de las muestras de cerebro humano después de la tinción para NAD+-dependiente de actividad de la LDH (A) contra condiciones de control (en el sustrato de la ausencia y del piruvato, 3 mM NAD+ sólo) (B) contra 150 mM lactato en ausencia de piruvato (C) contra 6 mM lactato en ausencia de piruvato y (D) contra 6 mM lactato en presencia de piruvato de 18 mM, el inhibidor competitivo producto de la reacción de lactato a piruvato. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56843/56843fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enzima:</td>
			<td>G6PDH</td>
			<td>LDH</td>
			<td>SDH</td>
			<td>MDH</td>
			<td>IDH1</td>
			<td>IDH2</td>
			<td>IDH3</td>
			<td>6PGD</td>
			<td>GDH</td>
		</tr>
<tr>
<td>PVA 18% en 100 mM de tampón fosfato</td>
			<td>1 mL; pH = 7.4</td>
			<td>1 mL;  pH = 7.4</td>
			<td>1 mL;  pH = 8.0</td>
			<td>1 mL; pH = 7.4</td>
			<td>1 mL; pH = 7.4</td>
			<td>1 mL; pH = 7.4</td>
			<td>1 mL; pH = 7.4</td>
			<td>1 mL; pH = 8.0</td>
			<td>1 mL; pH = 8.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NitroBT</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
			<td>5 mg/40 μl mezclar</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NaN3 </td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM MgCl2</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM NAD+</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,8 mM NADP</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM de ADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>sustrato</td>
			<td>10 mM glucosa-6-fosfato</td>
			<td>lactato de 150 mM</td>
			<td>succinato de 50 mM</td>
			<td>ácido málico de 100 mM</td>
			<td>2 mM isocitrato</td>
			<td>2 mM isocitrato</td>
			<td>2 mM isocitrato</td>
			<td>10 mM 6-fosfo-galactonate</td>
			<td>ácido glutámico 10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>mPMS 0,32 mM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0,2 mM PMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Duración de la incubación</td>
			<td>5 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>60 min</td>
			<td>60 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>10 min</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
</tbody></table>
Tabla 1. Descripción esquemática del protocolo mapeo metabólico de Deshidrogenasas. Abreviaturas: ADP, difosfato de adenosina; (m) PMS (metoxi) -5-methylphenazinium sulfato de metilo; nitroBT, nitro azul de tetrazolio cloruro; G6PDH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; LDH, lactato deshidrogenasa; Sado, Succinato deshidrogenasa; MDH, malato deshidrogenasa; IDH, Isocitrato deshidrogenasa; 6PGD, 6-fosfogluconato deshidrogenasa; GDH, la glutamato deshidrogenasa.

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Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Aquí, presentamos un protocolo que puede utilizarse para visualizar microscópicamente y cuantificar la actividad de Deshidrogenasas en las células y tejidos y su cinética, función y localización subcelular.

Mapeo metabólico: Citoquímica enzimática cuantitativa y la histoquímica para determinar la actividad de Deshidrogenasas en células y tejidos

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

metabolic-mapping-quantitative-enzyme-cytochemistry-histochemistry-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K vistas.  University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands. Aquí, presentamos un protocolo que puede utilizarse para visualizar microscópicamente y cuantificar la actividad de Deshidrogenasas en las células y tejidos y su cinética, función y localización subcelular.

Video: Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Investigación

Inmunología e Infección

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

La evaluación de alteraciones hepáticas metabólicas durante la colonización progresiva de la libre de gérmenes de ratón por 1 H espectroscopía de RMN

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...