ويدعم R.J.M. "منحة الدكتوراه المجلس الطبي الأسترالي". وأيد هذا البحث "جمعية السرطان الهولندية" (منحة كوف يوفا 2014-6839). يشكر المؤلفون جونكر ألف الدكتور لمساعدته مع كتابة البروتوكول.

<ol>
	<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).</li><li>Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+enzymes+at+work:+metabolic+mapping+by+enzyme+histochemistry.">Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathobiology of Human Disease. , 3760-3774 (2014).</li><li>Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry:+protocols+for+2D+and+3D+quantification+in+microscopic+images.">Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images.</a> Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , (1992).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G., Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. , 355-432 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytophotometry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+cells.">Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells.</a> Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).</li><li>Butcher, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+in+tissue+sections+of+the+two+formazans+derived+from+nitroblue+tetrazolium+in+dehydrogenase+reactions.">The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions.</a> Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).</li><li>Matsumoto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biological applications of confocal microscopy. , (2002).</li><li>Errington, R. J., White, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamic+cell+volume+in+situ+by+confocal+microscopy.">Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).</li><li>Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driver+and+passenger+effects+of+isocitrate+dehydrogenase+1+and+2+mutations+in+oncogenesis+and+survival+prolongation.">The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).</li><li>Molenaar, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotection+of+IDH1-Mutated+Cancer+Cells+by+the+IDH1-Mutant+Inhibitor+AGI-5198.">Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198.</a> Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).</li><li>Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+gene+expression+analysis+reveals+glycolysis+and+acetate+anaplerosis+in+IDH1+wild-type+glioma+and+lactate+and+glutamate+anaplerosis+in+IDH1-mutated+glioma.">In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma.</a> Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).</li><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Webb, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , (1992).</li><li>Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phosphate-activated+Glutaminase+Activity+and+Its+Kinetics+in+Mouse+Tissues+using+Metabolic+Mapping+(Quantitative+Enzyme+Histochemistry).">Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry).</a> J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).</li><li>van Lith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+as+chemotactic+fuel+for+diffuse+glioma+cells:+are+they+glutamate+suckers?.">Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers?.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

البحوث المتعلقة بالأيض الخلوية تشهد حاليا نهضة للباحثين يدركون الآن أن الآثار الأيضية من أهمية حاسمة في نشوء المرض وعلاج الكثير من الأمراض. وبمساعدة من 1 أبحاث الأيض وعلاوة على ذلك، قبل زيادة توافر التقنيات التي توفر هذا الحقل من البحث مع أدوات أكثر من أي وقت مضى، بما في ذلك الطيف الكتلي والعلامات راديويسوتوبيك والقياس الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. لا حال من الأحوال تعيين الأيضية تقنية رواية، ولكن قدرتها على إعطاء معلومات متكاملة عن النشاط الإنزيمات في حالة تقريبا صحيح لطبيعة يجعل هذا الأسلوب أكثر أهمية من أي وقت مضى. 2
وتوجد في جميع الخلايا الحية، مما يشير إلى أن dehydrogenases نشأ في وقت مبكر جداً خلال تطور العوامل المساعدة+ NAD و NADP+ ولها أدوار رئيسية في الأيض الخلوي. 14 , حاليا، هناك 15 523 ردود فعل تحفيز الإنزيم التي تصنف على أنها ديهيدروجيناسيس وتحدث عبر جميع الأنواع. 16 نظرياً، نشاط جميع ردود فعل مختلفة من نازعة يمكن بشكل منفصل بالتحقيق اللف البروتوكول الأيضية رسم الخرائط الموضحة هنا. كل رد فعل الانزيمية فريدة من نوعها عن طريق الركيزة والعوامل المساعدة اللازمة لنشاطها. ولذلك، يمكن تحديد نشاط كل رد فعل الانزيمية استخدام تجربة تعيين ايضية مع الركازة الملائمة والعوامل المساعدة على المديين المتوسط ورد الفعل. بيد أن بعض isoforms الإنزيم تختلف في هذه الترجمة سوبسيلولار، مثل واحد isoform يحفز رد فعل في السيتوبلازم بينما isoform آخر يعمل في الميتوكوندريا. مثال جدير بالذكر هو IDH1 و IDH2، التي السابق هيولى وهذا الأخير mitochondrial واثنين من البروتينات المختلفة المشفرة بواسطة اثنين من جينات مختلفة. 11 1-ميثوكس-5-ميثيلفينازينيوم ميثيلسولفاتي (ميثوكس-PMS) و 5-ميثيلفينازينيوم ميثيلسولفاتي (PMS) يمكن استخدام كل كحاملات إلكترون لهذه التجارب. السابق لا يمر المتقدرية الأغشية، هذا الأخير. ولذلك، يجب استخدام التحقيقات على إنزيمات الميتوكوندريا (مثل IDH2) الدورة الشهرية بينما التحقيقات على إنزيمات سيتوسوليك (مثل IDH1) وينبغي أن تستخدم مبمس.
كما هو الحال مع العديد من التقنيات، اختلافات من هذا البروتوكول، مثل استخدام أنواع مختلفة من الأملاح تيترازوليوم، باستثناء إضافة الدورة الشهرية وأزيد الصوديوم، استخدام وسيلة متزايدة مائي، واختلاف الاحتضان والشطف مرات، موجودة، وقد تعمل بشكل جيد على قدم المساواة. لا يقتصر تطبيق رسم الخرائط الأيضية مع أملاح تيترازوليوم إلى ديهيدروجيناسيس. مع تعديلات صغيرة إلى البروتوكول، يمكن أيضا استخدامه لتقييم نشاط الإنزيمات التي تعمل مباشرة المنبع لنازعة في مسار الأيض. لقد قمنا سابقا بوصف هذا المبدأ للانزيم جلوتاميناسي،17 التي تعمل مباشرة المنبع من نازعة غلوتامات في مسار جلوتامينوليسيس. 18 من الناحية النظرية، يمكن تطبيق نفس المبدأ للإنزيمات الأخرى أن دورة الدالة مباشرة المصب أو المنبع لنازعة مثل أكونيتاسي، التي تقع مباشرة أعلى النهر IDH2 و IDH3 في حامض تريكاربوكسيليتش (TCA). اختلاف بسيط آخر هو التركيز المبينة في الجدول 1 عن طريق جعل حضانة قنينة متوسطة بتركيزات مختلفة من الركازة، مساعد و/أو مثبط. يسمح هذا جيل منحنيات جرعة النشاط كدالة لتركيز الركازة، مساعد و/أو تثبيط.
يتحدث من الناحية الفنية، الأيضية والتجارب رسم الخرائط لا تيسر الملاحظات غير متحيزة في الموقع نشاط الإنزيم، للباحثين لاختيار تركيز الركيزة ومساعد قد لا تعكس مستويات الركيزة ومساعد أن يتم هذا في الموقع. وعلاوة على ذلك، استخدام لزج 18% بولي في الأجلين المتوسط ورد فعل يساعد على إبقاء الجزيئات سليمة، في المكان وفي تكيف ولكن يحظر نشر فعالة من الكواشف الوزن الجزيئي المنخفض من خلال وسيلة رد فعل. 3 , 5 ولذلك أنشطة إنزيم العزم في التجارب الموضحة هنا أن استخدام تركيزات الركيزة سوبرافيسيولوجيكال لا تعكس الحالة في فيفو بتركيز الركازة معين بل مناسبة مقارنات بين التجريبية. وبالتالي، من نتائج تجارب رسم الخرائط الأيضية قدرة الإنتاج (أقصى نشاط) فعل الانزيمية في السياق مستويات الركيزة ومساعد الموجودة على هذا الموقع. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام تركيزات مختلفة من الركازة و/أو العوامل المساعدة وعينات متعددة غير متحيزة مقارنة بالطاقة الإنتاجية القصوى (Vmax) وتقارب (كم) من إنزيم الركازة/مساعد في الأعمال التحضيرية للخلية ، الأنسجة أو مناطق الأنسجة. هذه المعلمات هي نتيجة لمجموع إنزيم البروتين التعبير والتعديلات بوستترانسلاشونال وأثر المكروية مزدحمة على نشاط الإنزيمات. ولذلك، تعيين الأيضية لا تزال انعكاسا أفضل لنشاط إنزيم من التجارب التي تحدد التعبير البروتين أو تنقية إنزيم النشاط في المختبر.

ركنا أساسيا في الفيزيولوجيا الخلوية هو التمثيل الغذائي. الأيض يوفر الخلايا بالطاقة اللازمة لجميع العمليات الفسيولوجية ويسلم اللبنات الأساسية للتركيب الحيوي الجزيئات، وينظم التوازن الخلوية فيما يتعلق بمنتجات النفايات وجزيئات سامة والتفكيك و إعادة تدوير مكونات الخلوية معطلة أو غير الضرورية. تحفيز ما يقرب من جميع التفاعلات الكيميائية الخلوية الحيوية الإنزيمات وبالتالي هي الوحدات الحركية في فسيولوجيا الخلايا. 1 , 2
أحكام تنظم نشاط الإنزيمات على مستويات عديدة وذلك كمية الإنزيم هيستوتشيميستري وسيتوتشيميستري (وتسمى أيضا تعيين الأيضية) هو الأسلوب المفضل لدراسة نشاط إنزيم في الموقع. أما على المستوى النسخي، هو تنظيم التعبير الجيني في مرناً. ويمكن تحديد أثر تنظيم النسخ استخدام الكمية فحوصات مرناً، مثل [ميكروارس] أو تسلسل الحمض النووي الريبي مباشرة، أو فحوصات مرناً النوعية، مثل التهجين في الموقع الذي يعطي معلومات عن الخلوية (الفرعية) ترجمة جزيئات مرناً. وهذا يجعل من الممكن أن نقدر الفروق النسبية في النشاط الترانسكربتي بين الخلايا. ومع ذلك، معقد التفسير وصحة هذه فحوصات مرناً فيما يتعلق بالنشاط الأيضي للتنظيم يحدث أيضا على مستوى مرناً، حيث تسلسل واستقرار الجزيئات مرناً يتم تحريرها بعد ذلك يتم نسخها من الحمض النووي. وينظم هذا التحرير ترجمة isoform البروتين وكمية البروتين الترجمة في ريبوسوم. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم في عملية ترجمة البروتين ويؤثر في نهاية المطاف على التعبير الإنزيم وبالتالي النشاط. يمكن تقدير الآثار المجتمعة للخطوات التنظيمية المشار إليها أعلاه باستخدام فحوصات التعبير كمية البروتين، مثل "النشاف الغربية" أو المرحلة عكس البروتين ليستي [ميكروارس]، أو فحوصات التعبير البروتين النوعي، مثل إيمونوسيتوتشيميستري وإيمونوهيستوتشيميستري، ولكن هذه التقنيات تعجز عن إدماج الآثار التنظيمية المصب مثل تعديل بوستترانسلاشونال للبروتينات واللائحة الوظيفية للإنزيمات في المكروية مزدحمة بهم. وعلاوة على ذلك، التعبير عن إنزيم قد سيئة ترتبط بنشاطها، حتى أن قياسات النشاط إنزيم المنقي في هوموجيناتيس الخلايا أو الأنسجة أو حلول مخففة تستخدم على نطاق واسع للدراسات نشاط الإنزيم. ومع ذلك، تفشل هذه التجارب لتكرار تأثير السيتوبلازم مجزأة مزدحمة أو عضية على نشاط إنزيم. وعلاوة على ذلك، تحديد الكمية أو إضفاء الطابع المحلي على التعبير مرناً أو إنزيم جميع التقنيات المذكورة أعلاه، ولكن غير قادر على إعطاء معلومات شاملة عن كل جوانب هذه التعبير الإنزيم، ناهيك عن إدماج هذا المعلومات مع قرارات نشاط الإنزيم. 2 , 3 , 4
تعيين الأيضية يسمح التقدير لكل من المتغيرات المذكورة آنفا التي تحدد نشاط إنزيم. ما هو أكثر من ذلك، هو تعيين الأيضية شكلاً من أشكال الخلايا الحية أو تصوير الأنسجة مع الخلايا والأنسجة التي يتم الاحتفاظ بها سليمة أثناء تحليل لتوليد حالة تقريبا صحيح لطبيعة لتوليد بيانات نشاط الإنزيمات. وتنتج الصور التي تسهل كل تقدير مفصل موقع نشاط إنزيم، فضلا عن قوي التحديد الكمي لنشاط إنزيم داخل حجرة الخلايا أو الأنسجة. 3 , 4 البروتوكولات المبينة هنا لرسم خرائط الأيضية لنشاط dehydrogenases تستند على دليل المختبرات كافة أساليب histochemical الإنزيم المتاحة،5 في مبادئ كمية الإنزيم هيستوتشيميستري،6 وفي تحليل الصور من الخرائط الكمية الأيضية. 4
ديهيدروجيناسيس هي الإنزيمات التي تقوم بتفاعلات الأكسدة والاختزال لتقليل العوامل المساعدة المتعارف عليه مثل NAD+، NADP+ وبدعة إلى NADH ونادف والقوات المسلحة الهايتية2، على التوالي. هي المحتضنة خلايا سليمة أو أقسام الأنسجة كريوستات التي هي غير ثابتة كيميائيا في متوسط رد فعل الذي يتضمن، بين الكواشف الأخرى، والركيزة، والعوامل المساعدة من نازعة محددة وملح تيترازوليوم. وفي وقت لاحق، أن نازعة ينفذ نشاط الحفاز ويقلل من NADP+ إلى نادف، على سبيل المثال،. عبر ناقلة إلكترون، تخفيض 2 نادف الجزيئات في نهاية المطاف 1 جزيء الملح tetrazolium شبه عديم اللون للذوبان في الماء في جزيء 1 formazan الأزرق تستعصي على الحل المياه رواسب فورا في موقع نازعة. ولذلك، امتصاص formazan سرع مقياسا مباشرا للنشاط المحلي لنازعة ويمكن ملاحظتها باستخدام الفحص المجهري الخفيفة أو كمياً باستخدام تحليل الفحص المجهري وصورة الضوء أحادي اللون. الجانب الكمي لهذا البروتوكول يتيح للباحثين ﻻستخﻻص النتائج الإحصائية من هذه الاختبارات. وبالإضافة إلى ذلك، يسهل هذا التحديد الكمي البت في الموقع معلمات إنزيم الحركية، مثل نشاط إنزيم القصوى (Vmax) وتقارب من الركازة لأنزيم (كم). 3 , 4 , 5 , 6
عند التخطيط لتجربة تعيين ايضية، من المهم أن ندرك أن كل تجربة، ويوصي بحد أقصى خمسين الشرائح الزجاجية مع المنضمة خلية الأعمال التحضيرية أو أقسام الأنسجة لتقليل التأخيرات الزمنية أثناء الحضانة من أجل الحصول على متسقة النتائج. فمن الممكن عملية أكثر الشرائح و/أو التراكيب المتوسطة عندما تنفذ هذه الخطوات بروتوكول تعاوني بالمجرب أكثر. وعلاوة على ذلك، يوجد بعض التغير بين التجارب. ولذلك، يجب تكرار تجارب مماثلة على الأقل 3 مرات مع سيتوسبينس من كل إعداد الخلية أو مقاطع من كل عينة الأنسجة وضوابط ملائمة ينبغي أن تدرج في كل تجربة. دائماً إعداد وسيلة احتضان تحكم في غياب الركيزة ولكن وجود العوامل المساعدة على مراقبة لتلطيخ نشاط إنزيم غير محددة. النتائج الأكثر تمثيلاً يتم الحصول عليها في تجارب فيه تركيزات مختلفة الركازة/مساعد يتم تطبيقها على أقسام الأنسجة أو الخلايا الاستعدادات من نفس العينة، حيث أن المجرب يمكن إجراء تحليلات لأنزيم حركية استخدام منحنيات جرعة النشاط.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2754</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Glucose 6-phosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">106559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium succinate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I1252&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Malic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Glycerol Gelatin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Lithium 6-phospho-D-galactonate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">55962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">methoxy-Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28966.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0505&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NADP-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">32030.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium L-lactate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:343px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Grey-step wedge</td>
			<td style="width:343px;">Stouffer Industries</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.stouffer.net/TransPage.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues

تغيير الأيض الخلوية سمة مميزة للكثير من الأمراض، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والإصابة. الوحدات الحركية الأيضية للخلايا الإنزيمات وينظم نشاطهم بشكل كبير على العديد من المستويات، بما في ذلك النسخي، الاستقرار مرناً، ومستوى متعدية الجنسيات وبوستترانسلاشونال والوظيفية. يعني هذا النظام المعقد أن فحوصات الكمية أو التصوير التقليدي، مثل كمية مرناً التجارب و "اسطوانات يقوم الغربية" وإيمونوهيستوتشيميستري، تسفر عن معلومات غير مكتملة فيما يتعلق بهذا النشاط في نهاية المطاف من الإنزيمات، وظيفتها و/أو تعريب سوبسيلولار بهم. كمية الإنزيم سيتوتشيميستري وهيستوتشيميستري (أي، تعيين الأيضية) إظهار معلومات متعمقة في النشاط الأنزيمي في الموقع وحركية، ووظيفتها والتعريب سوبسيلولار في حالة شبه الحقيقي للطبيعة.
يصف لنا وضع بروتوكول للكشف عن نشاط ديهيدروجيناسيس، وهي الإنزيمات التي تقوم بتفاعلات الأكسدة والاختزال للحد من العوامل المساعدة مثل NAD(P)+ وبدعة. أقسام الأنسجة والخلايا هي المحتضنة في متوسط التي محددة للنشاط الأنزيمي من نازعة واحد. في وقت لاحق، ينفذ نازعة الذي يخضع للتحقيق النشاط الأنزيمي في موقعها سوبسيلولار. في تفاعل كيميائي مع المتوسط رد فعل، ينشئ هذا في نهاية المطاف formazan زرقاء اللون في موقع النشاط نازعة. ولذلك امتصاص فورمازان مقياسا مباشرا للنشاط نازعة ويمكن قياسها كمياً باستخدام تحليل الفحص المجهري وصورة الضوء أحادي اللون. الجانب الكمي لهذا البروتوكول يتيح للباحثين ﻻستخﻻص النتائج الإحصائية من هذه الاختبارات.
بالإضافة إلى دراسات قائمة على الملاحظة، يمكن استخدام هذا الأسلوب للدراسات تثبيط إنزيمات معينة. وفي هذا السياق، دراسات تستفيد من مزايا حقيقية لطبيعة التعيين الأيضية، قد يكون إعطاء النتائج في الموقع أن فسيولوجيا ذات الصلة أكثر مما في المختبر الدراسات تثبيط إنزيم. في كل شيء، تعيين الأيضية أسلوباً لا غنى عنه لدراسة التمثيل الغذائي على المستوى الخلوي أو الأنسجة. من السهل أن تعتمد التقنية ويوفر معلومات متعمقة وشاملة ومتكاملة الأيضية ويتيح التحليل الكمي السريع.

وترد عدة بروتوكولات لإعداد المتوسطة الحضانة للتحقيق في نشاط نازعة خاصة. لكل من نازعة، حل الكواشف المذكورة في الحل بولي مع الحفاظ على درجة حرارة على الأقل 37 درجة مئوية. الكواشف ينبغي أن تحل بالترتيب المحدد في الجدول و أي نيتروبت دائماً يحل أولاً (م) الدورة الشهرية دائماً حل آخر. يتم حل كل 5 ملغ من نيتروبت في مزيج ميليلتر 40 (20 ميليلتر الإيثانول + 20 ميليلتر dimethylformamide). كافة وحدات التخزين لكل 1 مل من محلول بولي 18%، التي يمكن استخدامها لوصمة عار ~ 2 أقسام الأنسجة أو ~ 4 خلية الاستعدادات على الشرائح الزجاجية. نيتروبت نادٍ+، NADP+، ينبغي بذل الحلول ADP والركيزة الطازجة. نان3ومجكل2 (م) الدورة الشهرية حلول يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. 18% بولي حله في الفوسفات ويمكن تخزين المخزن المؤقت عند 60 درجة مئوية لمدة أسبوعين. يمكن تعيين الرقم الهيدروجيني للحل بولي 18% باستخدام تركيبات مختلفة من فوسفات هيدروجين البوتاسيوم 0.1 M (خ2ص4) و 0.1 M ثنائي الهيدروجين الفوسفات (نا2هبو4) المخازن المؤقتة. فترات حضانة أظهرت توفر نقطة انطلاق جيدة، ولكن فترات حضانة المثلى تعتمد على الأنواع ونوع الأنسجة والحفاظ على النسيج. وبصفة عامة، ينبغي المحتضنة الاستعدادات خلية أطول من أقسام الأنسجة للحصول على مستوى مماثل لإنتاج فورمازان.
نازعة إيسوسيتراتي البرية من نوع 1 و 2 (IDH1/2) تحفيز تحويل إيسوسيتراتي إلى α-كيتوجلوتاراتي (αKG) مع ما يصاحب ذلك انخفاض NADP+ إلى نادف في السيتوبلازم والميتوكوندريا، على التوالي. هذه الإنزيمات وقد اجتذبت اهتمام مؤخرا نظراً لحدوث الطفرات IDH1/2 في أنواع مختلفة من السرطان البشري، بما في ذلك سرطان الدماغ الأولية (جليوبلاستوما)، وسرطان القولون والمستقيم، وتوفر فرصة فريدة لإظهار إمكانيات تعيين الأيضية. الطفرات IDH1 تعطيل نشاط إنزيم البرية من نوع IDH1 وحمل أيضا نشاطا الجدد الانزيمية التي تؤدي إلى إنتاج وتراكم اللاحقة من أونكوميتابوليتي د-2-هيدروكسيجلوتاراتي (د-2 HG)،11 وناقش في أماكن أخرى بالتفصيل. 12 وأظهرت التجارب الأيضية رسم الخرائط أن NADP+-تعتمد IDH1/2 النشاط كان أقل بكثير في خلايا سرطان القولون والمستقيم مع طرقت في متخالف IDH1 طفرة من خلايا سرطان القولون والمستقيم التي كانت IDH1 البرية من نوع (الشكل 1A). كان هذا الاختلاف كمياً بتحليل الصورة photomicrographs الضوء أحادي اللون (الشكل 1B). 12
ويرد مثال آخر يوضح التجارب الأيضية رسم الخرائط في الشكل 2، والذي هو صورة لمقطع كريوستات الدماغ الماوس التي تم حقن الخلايا جليوبلاستوما البشرية. IDH1/2 هو موفر نادف الأكثر أهمية في الدماغ البشري ونشاطها أوبريجولاتيد في البرية من نوع جليوبلاستوما IDH1/2 ، بينما قدرة إنتاج نادف IDH1/2 أقل بكثير في أدمغة القوارض. 11 الشكل 2A يظهر الفرق بين NADP عالية+-يعتمد نشاط IDH1/2 في الخلايا جليوبلاستوما البشرية و NADP منخفض+-تعتمد IDH1/2 النشاط في الدماغ صحية الماوس. النشاط IDH1/2 هو كمياً كإنتاج نادف µmol كل مل الأنسجة الدقيقة في الشكل 2.
رد فعل الانزيمية IDH1/2 بسيط نسبيا، ولكن نازعة لاكتات (رابطة حقوق الإنسان) إنزيم أكثر تعقيداً معقدة. رابطة حقوق الإنسان يحول تحويل عكسها من اللاكتات إلى بيروفات مع ما يصاحب ذلك انخفاض NAD+ إلى NADH أو العكس بالعكس. توافر لاكتات وبيروفات وتكوين الإنزيم رابطة حقوق الإنسان المعقدة ويملي سواء لاكتات يتم تحويلها أساسا إلى بيروفات (الذي هو تحفزها رابطة حقوق الإنسان-ب وغلات NADH) أو ما إذا كان يتم تحويل بيروفات أساسا إلى لاكتات (والذي تحفزها رابطة حقوق الإنسان، ويستهلك NADH). تجارب تعيين 13 الأيضية قادرون على تصور نشاط رابطة حقوق الإنسان-ب رد فعل، لكنها "الأعمى" لنشاط رابطة حقوق الإنسان-برد فعل لأنه لا يحدث إنتاج NADH ونتيجة لذلك لم يتم خفض نيتروبت إلى فورمازان. ويبين الشكل 3 NAD+-الفرعين يعتمد نشاط رابطة حقوق الإنسان (أي تحويل اللاكتات إلى بيروفات) في الدماغ البشري في غياب الركيزة (الشكل 3 ألف)، وجود تركيزات عالية من لاكتات (الشكل 3B )، وحضور لاكتات 6 مم (الشكل 3)، وحضور تركيز منخفض من لاكتات وتركيز أعلى من بيروفات (3D الشكل). وتوضح نتائج هذه التجارب الأيضية رسم الخرائط على نحو كاف يلتقط أن ند+-يعتمد نشاط رابطة حقوق الإنسان في أقسام الأنسجة يعتمد على توافر لاكتات وبيروفات في الأجلين المتوسط ورد فعل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig1.jpg">
الشكل 1 . NADP+-IDH1/2 يعتمد نشاط الخلايا البشرية سرطان القولون والمستقيم. Photomicrographs (A) الضوء أحادي اللون الممثل HCT116 الخلايا البشرية سرطان القولون والمستقيم بعد تلطيخ ل NADP+-يعتمد نشاط IDH1/2 ضد 1-10 مم إيسوسيتراتي و 0.8 ملم NADP+. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. (ب) إجراء تقييم كمي لامتصاص فورمازان الأزرق ينتج من نيتروبت من NADP+--يظهر النشاط IDH1/2 تعتمد كل خلية باستخدام الضوء أحادي اللون في (أ) وتحليل الصور. المختصرات: IDH1WT/WT، نازعة إيسوسيتراتي 1 البرية من نوع؛ IDH1WT/موت، نازعة إيسوسيتراتي 1 تحور. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56843/56843fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig2.jpg">
الشكل 2 . NADP+-يعتمد نشاط IDH1/2 من عينات جليوبلاستوما البشرية. (أ) الصورة المجهرية ممثل قسم الدماغ الماوس يحتوي على الماوس صحية الدماغ (ح) ومن إكسينوجرافت ورم جليوبلاستوما بشرية (t) بعد تلطيخ ل NADP+-النشاط IDH1/2 يعتمد حضور 0.8 مم NADP+ وإيسوسيتراتي 2 مم. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (ب) إنزيم النشاط الكمي لمناطق الدماغ الماوس (ح) وجليوبلاستوما البشرية إكسينوجرافت (t) المبينة في (أ) باستخدام قانون بير لامبرت. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56843/56843fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig3.jpg">
الشكل 3 . NAD+-النشاط يعتمد لاكتات نازعة (رابطة حقوق الإنسان) من عينات المخ البشري. Photomicrographs الممثل من مقاطع المسلسل لعينات المخ البشري بعد تلطيخ لند+-يعتمد نشاط رابطة حقوق الإنسان (أ) ضد ظروف التحكم (في غياب الركيزة وبيروفات، 3 مم NAD+ فقط) (ب) ضد لاكتات 150 مم في غياب بيروفات (ج) ضد 6 مم لاكتات في غياب بيروفات و (د) ضد لاكتات 6 مم حضور 18 ملم بيروفات، مثبط تنافسية المنتج من رد فعل اللاكتات إلى بيروفات. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56843/56843fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>إنزيم:</td>
			<td>G6PDH</td>
			<td>رابطة حقوق الإنسان</td>
			<td>تشبيك ضوئي متزامن</td>
			<td>MDH</td>
			<td>IDH1</td>
			<td>IDH2</td>
			<td>IDH3</td>
			<td>6PGD</td>
			<td>جد</td>
		</tr>
<tr>
<td>بولي 18% في المخزن المؤقت للفوسفات 100 مم</td>
			<td>1 مل؛ pH = 7.4</td>
			<td>1 مل؛  pH = 7.4</td>
			<td>1 مل؛  pH = 8.0</td>
			<td>1 مل؛ pH = 7.4</td>
			<td>1 مل؛ pH = 7.4</td>
			<td>1 مل؛ pH = 7.4</td>
			<td>1 مل؛ pH = 7.4</td>
			<td>1 مل؛ pH = 8.0</td>
			<td>1 مل؛ pH = 8.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 مم نيتروبت</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
			<td>مزيج ميليلتر 5 ملغ/40</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 مم نان3 </td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5 مم مجكل2</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 مم NAD+</td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.8 ملم NADP</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2 مم ADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>الركيزة</td>
			<td>10 ملم الجلوكوز-6-فوسفات</td>
			<td>لاكتات 150 مم</td>
			<td>succinate 50 مم</td>
			<td>حمض malic 100 مم</td>
			<td>إيسوسيتراتي 2 مم</td>
			<td>إيسوسيتراتي 2 مم</td>
			<td>إيسوسيتراتي 2 مم</td>
			<td>10 ملم 6-والرمات-جالاكتوناتي</td>
			<td>حمض الغلوتاميك 10 ملم</td>
		</tr>
<tr>
<td>مبمس 0.32 مم</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2 مم الدورة الشهرية</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td>10 ميليلتر</td>
			<td></td>
			<td>10 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>مدة حضانة المرض</td>
			<td>5 دقيقة</td>
			<td>30 دقيقة</td>
			<td>60 دقيقة</td>
			<td>60 دقيقة</td>
			<td>30 دقيقة</td>
			<td>30 دقيقة</td>
			<td>30 دقيقة</td>
			<td>10 دقيقة</td>
			<td>30 دقيقة</td>
		</tr>
</tbody></table>
الجدول 1. نظرة عامة على التخطيطي البروتوكول رسم الخرائط الأيضية ل dehydrogenases. المختصرات: ADP أدينوسين ديفوسفاتي؛ (م) الدورة الشهرية (ميثوكس)-5-كبريتات ميثيلفينازينيوم الميثيل؛ نيتروبت، كلوريد تيترازوليوم الأزرق نيترو؛ G6PDH، نازعة الجلوكوز-6-فوسفات؛ رابطة حقوق الإنسان، لاكتات نازعة؛ المحددات، نازعة succinate؛ MDH، نازعة مالات؛ IDH، نازعة إيسوسيتراتي؛ 6PGD، نازعة 6-فوسفوجلوكوناتي؛ جد، نازعة غلوتامات.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues at JoVE.com

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

نقدم هنا، بروتوكول التي يمكن استخدامها لتصور مجهريا وتحديد حجم النشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة والحركية، ووظيفتها والتعريب سوبسيلولار.

الأيضي رسم الخرائط ذات الصلة: سيتوتشيميستري كمية إنزيم وهيستوتشيميستري لتحديد نشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

metabolic-mapping-quantitative-enzyme-cytochemistry-histochemistry-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Views.  University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands. نقدم هنا، بروتوكول التي يمكن استخدامها لتصور مجهريا وتحديد حجم النشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة والحركية، ووظيفتها والتعريب سوبسيلولار.

Video: Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

تقييم التغيرات الأيضية الكبدي خلال الاستعمار التدريجي الماوس مجانا من جرثومة 1 H NMR الطيفي

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

الاستفادة المثلى من الكمية الصغيرة تحييد الفحص

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...