Agradecemos a Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidad de Tokio, Japón) por proporcionar amablemente la plásmidos codifican 3xFLAG LRRK2 WT y mutantes. También agradecemos a Dr. Dario Alessi (Universidad de Dundee, Reino Unido) por proporcionar amablemente MLi-2 y el plásmido codificación HA-Rab10. Este trabajo fue apoyado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI concesión número JP17K08265 (G.I.).

<ol>
	<li>Sveinbjornsdottir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+symptoms+of+Parkinson's+disease.">The clinical symptoms of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).</li><li>Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+in+Parkinson+disease:+Mendelian+versus+non-Mendelian+inheritance.">Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).</li><li>Pais&#225;n-Ru&#237;z, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li><li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li><li>Gilks, W. 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Ther. 355, 397-409 (2015).</li><li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser(910)/Ser(935),+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization.">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).</li><li>Th&#233;venet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+LRRK2+expression+points+to+a+functional+role+in+human+monocyte+maturation.">Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation.</a> PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un método robusto y fácil de detectar Rab10 fosforilación de LRRK2 nivel endógeno basado en la metodología de la etiqueta P. Porque el anticuerpo actualmente disponible contra Rab10 fosforilada sólo funciona con las proteínas sobreexpresadas15, el presente método utiliza la etiqueta P SDS-PAGE es la única manera de evaluar los niveles endógenos de la fosforilación Rab10. Por otra parte, el presente método permite la estimación de la estequiometría de la fosforilación en las células Rab10. Porque la metodología de la etiqueta P es genéricamente aplicable a fosfo-proteínas, el presente Protocolo puede ser un "prototipo" para el establecimiento de métodos similares para otros fosfo-proteínas.
Pasos críticos en el protocolo son geles de casting y preparación de muestras. Acrilamida de la etiqueta P es un reactivo relativamente lábil foto y la capacidad de retardar la movilidad electroforética de las proteínas fosforiladas a veces se pierde después de almacenamiento a largo plazo a 4 ° C. Los investigadores deben tomar cada cuidado para evitar la exposición a acrilamida etiqueta P a la luz. Además, la molécula de P-etiqueta necesita formar un complejo con iones2 + Mn para capturar los fosfatos. Por lo tanto, las muestras no deben contener a agentes quelantes como el EDTA, que son generalmente componentes comercialmente disponibles buffer de muestra de SDS-PAGE. Se recomienda utilizar el tampón de muestra de Laemmli clásica para preparar muestras para etiqueta P SDS-PAGE.
Otro punto crítico es bien optimizar las concentraciones de acrilamida, etiqueta P acrilamida y MnCl2 en la mezcla del gel de separación (Figura S2). Las distancias de migración de bandas fosforiladas y no fosforiladas variará dependiendo de los reactivos utilizados (lote, pureza, etc.), y la optimización de las concentraciones adecuadas probando varias concentraciones diferentes en combinación es obligatorio (por ejemplo, etiqueta P acrilamida (25, 50, 75 μm), MnCl2 (1:2 o 1:3 relación molar a acrilamida etiqueta P) y acrilamida (7,5, 10, 12,5%)). Las bandas fosforiladas y no fosforiladas aparecen en medio de los geles y bien separaron entre sí. Para el proceso de optimización, se recomienda utilizar Rab10 sobreexpresado porque la banda cambió de puesto es fácilmente detectable. Los autores pueden proporcionar muestras de control para este protocolo.
Uno de la confusión más grande que puede causar este Protocolo será debido a la diferencia de los patrones de migración de la MWM entre regular y geles de SDS-PAGE de la etiqueta P. Como se muestra en la Figura S3, los patrones de migración de MWM en regular y geles de SDS-PAGE de la etiqueta P (ambas 10%) son muy diferentes y uno no puede usar el MWM para estimar el peso molecular de proteínas en geles de SDS-PAGE de la etiqueta P. Sin embargo, en geles de SDS-PAGE de la etiqueta P, uno de lo MWM destaca por migrar a la mitad del gel (flecha en Figura S3), que constantemente se observa entre geles (véase la Figura S4). Este MWM siempre migra entre las bandas de Rab10 fosforilados y no fosforilados. Por lo tanto, este marcador es útil no sólo para garantizar que la etiqueta P SDS-PAGE funciona antes de la transferencia, sino también como un punto de referencia para tener una sensación áspera de donde se verá las bandas de Rab10 fosforilados y no fosforilados.
Para la detección de bandas immunoblots, hemos utilizado un sensor equipado con una cámara CCD refrigerada (véase Tabla de materiales) así como una radiografía convencional película sistema en desarrollo y encontró que ambos sistemas trabajan bien. Para la detección de niveles endógenos de la fosforilación Rab10 en cultivos de células, es necesario utilizar líneas celulares que tienen niveles de expresión alta de LRRK2 endógenos, tales como fibroblastos embrionarios de ratón (ya sea primaria cultivadas o inmortalizado (líneas) de la célula Albino Swiss 3T3, etc.)) y las células de pulmón humano derivadas de carcinoma A549. Para la detección de niveles endógenos de la fosforilación Rab10 en tejidos de ratón, se recomienda utilizar el pulmón16.
La cuantificación de la fosforilación Rab10 no es más allá de la habitual immunoblotting. Si la estequiometría de la fosforilación Rab10 es muy baja (como se muestra en la figura 3), la intensidad de la banda no-phosphorylated (marcado con un círculo cerrado) tiende a ser muy por encima del nivel de saturación, haciendo la determinación precisa de la estequiometría imposible. Sin embargo, estimación cualitativa es posible en cualquier caso, que no es obtenible sin utilizar el método actual. Puesto que la detección de la fosforilación de Rab10 endógeno requiere una exposición prolongada, tiende a haber algunas bandas no específicos que aparecen en la etiqueta P blot aunque el anticuerpo anti-Rab10 usado en este protocolo da immunoblots bastante limpios para el uso normal . Para distinguir las proteínas phosphorylated de bandas inespecíficas, es fundamental para utilizar un control de tratamiento del inhibidor, en el cual bandas fosforiladas, pero bandas no inespecíficos, deben desaparecer. LRRK2 fosforila Rab8 además de Rab1015, y nos hemos aplicado con éxito el presente Protocolo a Rab8A así (datos no mostrados). El presente Protocolo potencialmente puede utilizarse para examinar la fosforilación de alguna proteínas, aunque puede haber dificultades técnicas si la proteína es grande (&#62; kDa 100) o multiplicar fosforilada. Porque Rab10 es una proteína pequeña (25 kDa) y fosforilada por separado en Thr73 de LRRK2, el resultado de la etiqueta P SDS-PAGE es simple donde se observa una única banda cambiada de puesto.
En un futuro próximo, será fundamental para establecer el método para detectar cuantitativamente la actividad quinasa de LRRK2 en muestras de paciente deriva de una forma de alto rendimiento para evaluar la alteración de la actividad quinasa de LRRK2 en pacientes con EP, así como evaluar el efecto de las drogas en LRRK2 en ensayos clínicos. Desde sangre periférica células mononucleares (PBMCs) expresan niveles relativamente altos de endógeno LRRK223, PBMCs o más células aisladas de sangre será prueba para fosforilación endógena de Rab10. El presente método no sólo ser útil en la investigación de la biología básica de la LRRK2 vía de señalización, sino que también ayuda en la obtención de un prueba de concepto básico para decidir que muestra en muestras derivadas de paciente debe ser analizado en estos estudios a gran escala.

PD es una de las enfermedades neurodegenerativas más comunes, que afecta predominante a las neuronas dopaminérgicas en el cerebro medio, dando por resultado la disfunción de los sistemas de motor en personas de edad avanzada1. Mientras que la mayoría de los pacientes desarrollará PD de manera esporádica, hay familias que heredar la enfermedad. Se han encontrado mutaciones en varios genes vinculados con FPD2. Uno de los genes causales de la FPD es LRRK2, en el que ocho mutaciones sin sentido (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S y I2020T) vinculadas a un dominante heredado FPD llamada PARK8 hasta ahora han sido reportados3,4,5. Varios estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) de pacientes con EP esporádicos también han identificado variaciones genómicas en el locus del LRRK2 como factor de riesgo para PD, lo que sugiere que la anormalidad en la función de LRRK2 es una causa común de la neurodegeneración en los esporádicos y PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 es una proteína grande (2.527 aminoácidos) que consiste en un dominio repetición rica en leucina, un Ras de unión a GTP dominio de proteínas complejas (ROC), un C-terminal de dominio, un dominio de la cinasa de serina/treonina proteína y WD40 dominio repetición9ROC (CDR). Las ocho mutaciones FPD localizar en estos dominios funcionales; N1437H y R1441C/G/H/S en el dominio ROC, Y1699C en el dominio de la COR, G2019S y I2020T en el dominio de la cinasa. Puesto que la mutación G2019S, que es lo más frecuentemente encontrado mutación en PD pacientes10,11,12, aumenta la actividad de la quinasa de LRRK2 en 2-3 veces en vitro13, se presume que el aumento anormal de fosforilación de los substratos de LRRK2 es tóxico para las neuronas. Sin embargo, ha sido imposible estudiar si se altera la fosforilación de sustratos fisiológicamente relevantes de LRRK2 en pacientes con EP familiar/esporádico debido a la falta de métodos de evaluación en muestras derivadas.
Fosforilación de la proteína es generalmente detectada por immunoblotting o análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) usando los anticuerpos específicamente reconociendo el estado fosforilado de proteínas o por análisis de espectrometría de masa. Sin embargo, la estrategia anterior a veces no se puede aplicar debido a las dificultades en la creación de anticuerpos específicos de fosforilación. Etiquetado metabólico de las células con fosfato radiactivo es otra opción para examinar niveles fisiológicos de la fosforilación de cuando los anticuerpos específicos de fosforilación no están disponibles. Sin embargo, requiere una gran cantidad de materiales radiactivos y por lo tanto implica algunos equipos especializados para protección radiológica14. El análisis de espectrometría de masa es más sensible frente a estos métodos inmunoquímicos y llegó a ser popular en el análisis de la fosforilación de la proteína. Sin embargo, la preparación de la muestra es desperdiciador de tiempo y costosos instrumentos son necesarios para el análisis.
Un subconjunto de la familia de Rab GTPase como Rab10 y Rab8 fue divulgado recientemente como sustratos fisiológicos directos para LRRK2 basan en el resultado de un análisis a gran escala phosphoproteomic del15. Entonces hemos demostrado que la fosforilación Rab10 fue aumentada por mutaciones de la FPD en fibroblastos embrionarios de ratón y en los pulmones de knockin ratones16. En este informe, optamos por emplear una electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método en el cual una molécula de P-tag es co polimerizada en geles de SDS-PAGE (etiqueta P SDS-PAGE) para la detección de los niveles endógenos de la fosforilación Rab10, basado en porque todavía le faltaba un anticuerpo altamente sensible específico para Rab10 fosforilada. Nosotros hemos podido detectar la fosforilación de Rab8 endógeno debido a la pobre selectividad de anticuerpos disponibles para Rab8 total. Por lo tanto, decidimos enfocarnos en la fosforilación Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 en Thr73 ubicación en el centro de la región altamente conservada "interruptor II". Conservación de los sitios de fosforilación entre proteínas Rab podría ser una de las razones por qué anticuerpos phosphospecific reconociendo distintas proteínas Rab son difíciles de hacer.
La fosforilación de Rab8A por LRRK2 inhibe la Unión de Rabin8, un factor de intercambio del nucleótido guanina (GEF) que activa Rab8A intercambiando el PIB consolidado con GTP15. Fosforilación de Rab10 y Rab8A por LRRK2 también inhibe la Unión de los inhibidores de la disociación de PIB (GDIs), que son esenciales para la activación de las proteínas Rab extrayendo proteínas Rab PIB-limite de membranas15. Colectivamente, se presume que la fosforilación de proteínas Rab por LRRK2 les impide la activación aunque el mecanismo molecular exacto y consecuencias fisiológicas de la fosforilación no quedan claros.
P-etiqueta SDS-PAGE fue inventado por Kinoshita et al. en 2006: en este método, acrilamida covalente fue juntada con la etiqueta P, una molécula captura de fosfatos con alta afinidad, que copolymerized en SDS-PAGE gel17. Porque las moléculas de P etiqueta en un gel de SDS-PAGE selectivamente retardan la movilidad electroforética de las proteínas fosforiladas, etiqueta P SDS-PAGE puede separar proteínas fosforiladas de los no-phosphorylated (figura 1). Si el proteína de interés es fosforilado en residuos múltiples, se observará una escalera de bandas correspondientes a las formas fosforiladas diferencialmente. En el caso de Rab10, observamos sólo una banda cambiada de puesto, lo que indica que Rab10 es fosforilado en Thr73. La gran ventaja de la etiqueta P SDS-PAGE en immunoblotting con anticuerpos específicos de fosforilación es que Rab10 fosforilada puede detectarse por immunoblotting con fosforilación-anticuerpos inespecíficos (es decir, reconocimiento total Rab10) Tras ser trasladado en las membranas, que suele ser más específicos, sensibles y disponibles de fuentes comerciales y académico. Otra ventaja de usar la etiqueta P SDS-PAGE es que se puede obtener una estimación aproximada de la estequiometría de la fosforilación, que es imposible por immunoblotting con anticuerpos específicos de fosforilación o por el etiquetado metabólico de las células con radiactivo fosfatos.
Aparte del uso de acrilamida etiqueta P barata y algunas modificaciones menores relacionados con ella, el método actual de detección de Rab10 fosforilación de LRRK2 sigue un protocolo general de immunoblotting.Por lo tanto, debe ser sencillo y fácilmente ejecutable en cualquier laboratorios donde immunoblotting es una práctica habitual, con cualquier tipo de muestras incluyendo proteínas purificadas, lysates de la célula y homogenados de tejido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31320-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-04245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4549</td>
			<td>Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium 
			(DMEM)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1560</td>
			<td>Heat-inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>342-01375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)</td>
			<td>PolySciences, Inc.</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>045-28335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RSP-THA500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-24751</td>
			<td>Equivalent to Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>346-01312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate(V)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-09752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>37174-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17103-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2113899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin-LR</td>
			<td>Wako</td>
			<td>136-12241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 &#176;C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31607-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>25099-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>056-06967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>136-01837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-binding tag acrylamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>AAL-107</td>
			<td>P-tag acrylamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% (w/v) acrylamide solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06119-45</td>
			<td>Acrylamide:Bis = 29:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>016-08021</td>
			<td>10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374, 1610373, 1610377</td>
			<td>Molecular weight marker used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td>
			<td>Wako</td>
			<td>230-02461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17109-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran NC 0.45</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600007</td>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Membrane Filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>GVHP00010</td>
			<td>PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Papers No.1</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>00013600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28322-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-00251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monolaurate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>345-01865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostar</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-55203</td>
			<td>ECL solution (Normal sensitivity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostar LD</td>
			<td>Wako</td>
			<td>290-69904</td>
			<td>ECL solution (High sensitivity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining solution</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB destaining solution</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11583816001</td>
			<td>Used at 0.2 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab10 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8127</td>
			<td>Used at 1:1000 for immunoblotting. 
			Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-pSer935 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133450</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LRRK2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133518</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa-Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>Used at 0.02 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>515-035-003</td>
			<td>Used at 0.16 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Used at 0.16 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK2578215A</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-13237</td>
			<td>Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLi-2</td>
			<td>Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td>
			<td>Provided by Dr Dario Alessi 
			(University of Dundee)</td>
			<td></td>
			<td>This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&#8211;1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&#8211;1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma Series II 3110 Water-Jacketed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Pipet-Aid PA-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P10</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-10</td>
			<td>0.5&#8211;10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P200</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-200</td>
			<td>20&#8211;200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P1000</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-1000</td>
			<td>100&#8211;1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P10</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RST-481LCRST</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P200</td>
			<td>FUKAEKASEI</td>
			<td>1201-705YS</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P1000</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RST-4810BRST</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disporsable pipette</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>606180</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disporsable pipette</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607180</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL disporsable pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357535</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocytometer</td>
			<td>Sunlead Glass</td>
			<td>A126</td>
			<td>Improved Neubeuer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>For tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>3810-006</td>
			<td>For tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RSV-MTT1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>2323-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>2343-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuges</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655061</td>
			<td>Not for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#8211;PAGE tanks</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tanks</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel plates (notched)</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel plates (plain)</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon spacers</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-well combs</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder clips</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-05SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2138R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Station 1000 VC</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-8450</td>
			<td>Power supply for SDS&#8211;PAGE and transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large weighing boats</td>
			<td>Ina Optika</td>
			<td>AS-DL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic containers</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>PS CASE No.4</td>
			<td>10 x 80 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Titech</td>
			<td>NR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene foam box</td>
			<td>generic</td>
			<td></td>
			<td>The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rab10 phosphorylation detection by lrrk2 activity using sds-page with a phosphate-binding tag

Mutaciones de la cinasa repetición rica en leucina 2 (LRRK2) han demostrado estar relacionados con la enfermedad de Parkinson familiar (FPD). Puesto que la activación anormal de la actividad quinasa de LRRK2 se ha implicado en la patogénesis de la EP, es esencial establecer un método para evaluar los niveles fisiológicos de la actividad quinasa de LRRK2. Estudios recientes revelaron que LRRK2 fosforila a miembros de la familia de Rab GTPase, incluyendo Rab10, bajo condiciones fisiológicas. Aunque la fosforilación de Rab10 endógeno de LRRK2 en células cultivadas podría detectarse por espectrometría de masas, ha sido difícil de detectar por immunoblotting debido a la pobre sensibilidad de anticuerpos específicos de fosforilación actualmente disponibles Rab10. Aquí, describimos un sencillo método para detectar los niveles endógenos de Rab10 fosforilación de LRRK2 basado en immunoblotting utilizando sodio electroforesis dodecyl del sulfato gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) combinado con una enlace de fosfato etiqueta (P-), que es N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. El presente Protocolo no sólo proporciona un ejemplo de la metodología que utiliza la etiqueta P pero también permite la evaluación de cómo mutaciones así como tratamiento y administración de inhibidor u otros factores alteran la señalización corriente abajo de LRRK2 en células y tejidos .

Sistema de sobreexpresión: Fosforilación de la HA-Rab10 por 3 × bandera-LRRK2 en HEK293 células:
Las células HEK293 fueron transfectadas con 0.266 μg de HA-Rab10 tipo de salvaje y 1.066 μg 3 × bandera LRRK2 (mutante de tipo salvaje, quinasa inactiva (K1906M), o mutantes FPD). Fosforilación de Rab10 fue examinada por etiqueta P SDS-PAGE seguido immunoblotting usando un anti-HA anticuerpo (figura 2). 10 μg de proteínas se corrieron en un gel 10% (80 x 100 x 1 mm) que contiene 50 acrilamida de etiqueta P μm y 100 μm MnCl2. El tiempo de exposición para el gel de la etiqueta P (panel superior) fue 10 s con una solución estándar de ECL. Co-sobreexpresión de LRRK2 con Rab10 causado cambio de banda en el gel de la etiqueta P (marcado con un círculo abierto en el panel superior; comparar carriles 2 y 4). En cambio, coexpresión con un mutante quinasa inactiva LRRK2 (K1906M) no se pudo cambiar la movilidad de los Rab10 (Comparar con carriles 4 y 5), lo que indica que el cambio de banda es debido a la actividad de la cinasa de LRRK2. El cambio de la banda fue aumentado en todas las mutaciones de FPD (Comparar con calles 4 y 6-13) acuerdo con el informe anterior15.
Sistema endógeno: Fosforilación de la Rab10 de LRRK2 en células cultivadas:
Células de fibroblastos embrionarios de ratón 3T3-Swiss albino fueron tratadas con o sin un inhibidor (GSK2578215A) de LRRK220 a una concentración final de 1 μm para 1 h (Figura 3A). Células pulmonares humanas A549 fueron tratadas con o sin otro LRRK2 inhibidor (MLi-2)21 a una concentración final de 10 nM para 1 h (figura 3B). Endógeno Rab10 fosforilación de LRRK2 endógena fue examinada por etiqueta P SDS-PAGE seguido immunoblotting con un anticuerpo anti-Rab10. 30 μg de proteínas se corrieron en un gel 10% (100 x 100 x 1 mm para las células 3T3-Swiss albino) y 80 mm para las células A549 con 50 etiqueta P acrilamida μm y 100 μm MnCl2. La exposición para el gel de la etiqueta P (panel superior) en la Figura 3A y 3B figura fueron 3 min y 90 s, respectivamente. Se observó el cambio de la banda correspondiente a Rab10 endógeno fosforilada en el gel de la etiqueta P (marcado con un círculo abierto en el panel superior; comparar carriles 1-2 y 3-4) que desapareció sobre el tratamiento de células con GSK2578215A o MLi-2. La eficacia de los inhibidores de LRRK2 fue validada por inmunotransferencia utilizando el anticuerpo anti-pSer935 del LRRK2 (el tercer panel de la parte inferior), que es una lectura bien establecida de la inhibición de LRRK2 en células22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig1.jpg"> 
Figura 1. Representación esquemática de la etiqueta P SDS – PAGE. Cuando una mezcla de fosforilada (círculos rojos) y las proteínas no-phosphorylated (círculos azules) (e.g., Rab10) corre a través de un gel de acrilamida etiqueta P se co polimerizada, la movilidad de las proteínas fosforiladas sólo retarda debido a la fuerte interacción de las proteínas fosforiladas con las moléculas de la etiqueta P (flechas quebradas). Ya que Rab10 es fosforilado por LRRK2 en un solo residuo de Thr73, Rab10 funciona como dos bandas: la banda superior representa Rab10 fosforilada y la banda inferior representa Rab10 no-phosphorylated. Cuando las células son tratadas con inhibidores de LRRK2, la banda superior debe desaparecer. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig2.jpg"> 
Figura 2. Resultado representativo de la mancha etiqueta P: sistema sobreexpresión. El panel superior muestra la mancha blanca /negra de la etiqueta P usando un anti-HA anticuerpo, donde Rab10 fosforilados y no fosforilados son marcados con abra (○) y cerrado círculos (●), respectivamente. Los paneles se muestra a continuación la mancha etiqueta P son immunoblots en geles de SDS-PAGE normales usando un anti-HA, anti-FLAG, anti-α-tubulina y anticuerpos anti-GAPDH. La mancha HA y bandera blot se muestran para asegurar la sobreexpresión de Rab10 HA y 3xFLAG-LRRK2, respectivamente. La α-tubulina y GAPDH lacras aparecen para asegurar la carga igual. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig3.jpg"> 
Figura 3. Resultado representativo de la mancha etiqueta P: sistema endógeno. Dos células, a saber: (A) albino Swiss 3T3 células y células A549 (B), fueron utilizados. En ambas figuras, los paneles superiores muestran que la etiqueta P blots utilizando un anticuerpo anti-Rab10, donde Rab10 endógeno fosforilados y no fosforilados se marcan con el abrir (○) y cerrado círculos (●), respectivamente. Los paneles que se muestra a continuación la bienvenida de etiqueta P son immunoblots en geles de SDS-PAGE normales usando un anti-Rab10 anti-pSer935 LRRK2, anti-LRRK2 y anticuerpos anti-α-tubulina. La Rab10 y LRRK2 aparecen para garantizar la expresión similar de endógeno Rab10 y LRRK2 entre las muestras, respectivamente. La pSer935 LRRK2 blot se muestran para asegurar que GSK2578215A (A) y MLi-2 (B) trabajó como se esperaba. La mancha de la α-tubulina se muestran para asegurar la carga igual. Las imágenes de las manchas blancas /negras de la etiqueta P superpuestas con el marcador de peso molecular se muestran en la Figura S4. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura S1. Secuencias de ADN de la plásmidos. Las secuencias de ADN del plásmido codificación FRT a HA-Rab10/pcDNA5 y el de 3 × × p3-LRRK2/bandera bandera-CMV-10. Todos los plásmidos utilizados en este protocolo están disponibles de los autores a petición. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S1.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura S2. Un ejemplo de la optimización de la etiqueta P SDS-PAGE. El mismo conjunto de muestras que se utiliza en la Figura 3A se utilizó para la optimización de la etiqueta P SDS-PAGE. Se analizaron cuatro diferentes condiciones como se muestra en la figura. Las bandas correspondientes a Rab10 fosforilados y no fosforilados se destacan con rectángulos de línea sólida y punteada, respectivamente.En base a este experimento, la condición con 10% de acrilamida, acrilamida de etiqueta P de 50 μm y 100 μm MnCl2 dio la mejor separación de las dos bandas, tanto localizar en medio del gel. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S2.tif">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura S3. Comparación del patrón de migración de un marcador de peso molecular de. El marcador de peso molecular (MWM) era correr en un gel de SDS-PAGE regular (panel de la izquierda) o en un gel de SDS-PAGE de la etiqueta P (panel central), y los geles fueron teñidos mediante tinción de Coomassie. El panel de la derecha muestra un immunoblot de las muestras utilizadas en la figura 2 (carril 4 y 5) en el mismo gel de SDS-PAGE de etiqueta P como el panel central para mostrar las posiciones de Rab10 fosforilados y no fosforilados. La punta de flecha en el lado derecho del immunoblot indica la posición de uno de lo MWM en el gel SDS-PAGE de la etiqueta P. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S3.tif">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura S4. La posición de un marcador de peso molecular en geles de SDS-PAGE de la etiqueta P. Imágenes digitalizadas de las membranas que se utiliza para figuras 3A y 3B de la figura se muestran como (A) y(B), respectivamente. Los immunoblots que se muestra en la figura 3 se superponen para mostrar la posición relativa del marcador de peso molecular (MWM). El MWM no transferencia bien a las membranas pero el marcador (flecha) Figura S3 fue débilmente pero consistentemente observado. La posición de la MWM está marcada con líneas punteadas. Tenga en cuenta que carriles irrelevantes las cifras entre lo MWM y los carriles de interés han sido tachados. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S4.tif">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

El presente estudio describe un método sencillo de detectar niveles endógenos de la fosforilación Rab10 quinasa repetición rica en leucina 2.

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K vistas.  The University of Tokyo. El presente estudio describe un método sencillo de detectar niveles endógenos de la fosforilación Rab10 quinasa repetición rica en leucina 2.

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Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Investigación

Bioquímica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

Detección de actividad de fosfolipasa C en el homogeneizado de cerebro de la abeja

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.

Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10